米非司酮對Wistar大鼠窗口期子宮內膜整合素和血管內皮生長因子基因表達的影響

唐 彬, 黎福榮, 付新錄, 江國建, 趙 勇, 張 薇

(中山大學實驗動物中心, 廣州510080)

米非司酮對Wistar大鼠窗口期子宮內膜整合素和血管內皮生長因子基因表達的影響

唐 彬, 黎福榮, 付新錄, 江國建, 趙 勇, 張 薇

(中山大學實驗動物中心, 廣州510080)

目的 研究米非司酮對大鼠窗口期子宮內膜整合素(αvβ3)、血管內皮生長因子(VEGF)基因表達, 探討其對子宮內膜超微結構的影響。方法 將36只Wistar大鼠分4組，1、2組妊娠1 d后分別服用5 mg/kg、10 mg/kg的米非司酮，3、4組為空白未妊娠組和空白妊娠組，4個組于4.5 d后麻醉取大鼠子宮內膜組織，進行透射電鏡觀察、ELISA檢測血清中雌激素、孕激素含量，同時運用實時熒光定量PCR技術，定量分析整合素αvβ3以及VEGF 基因在其子宮內膜中的表達。結果 米非司酮能明顯抑制Wistar大鼠窗口期子宮內膜αvβ3、VEGF基因的表達，同時能顯著降低窗口期孕激素的含量(P＜0.05)，其三者的下調及子宮內膜的超微結構的改變與米非司酮具有明顯的劑量依賴關系，對雌激素的含量沒有顯著影響(P＞0.05)。結論 米非司酮能在不同程度上降低大鼠整合素αvβ3、VEGF基因的表達及孕激素的含量，破壞子宮內膜的超微結構.

米非司酮; 整合素(αvβ3); 血管內皮生長因子(VEGF); 雌激素; 孕激素

整合素 (integrins) 為細胞粘附分子家族的重要成員之一, 是一組廣泛分布于細胞表面由α及β兩個亞單位(αvβ3)組成的跨膜糖蛋白受體, 主要介導細胞與細胞、細胞與細胞外基質(extracellular matrix,ECM)之間的相互黏附 , 并介導細胞與 ECM 之間的雙向信號轉導, 對細胞的黏附、增殖、分化、轉移、凋亡起著重要的調控作用[1-3]。同時，整合素αvβ3的表達在血管生成與重建過程中具有獨特的作用[4]。血管內皮生長因子 (vascular endothelial growth factor，VEGF) 是目前認為作用最強、特異性最高的促血管生成因子，是新生血管形成定量分析的較可靠指標。研究表明[5]，VEGF 的表達與血管生成明顯呈正相關，故 VEGF 能較好地反映新生血管生長的活躍程度，其在胚胎發育、骨骼生長和生殖等眾多生物學過程中起重要作用，且卵泡的生長和黃體的發育依賴于新生的毛細血管，而VEGF 對小鼠胚胎及新生鼠血管內皮細胞增殖和存活至關重要。VEGF 促進血管生成，是促進腫瘤血管生成的重要因子, 在腫瘤生長和轉移中起著不可或缺的作用[6,7]。αvβ3、VEGF是血管新生具有協同作用的重要因子，而新生血管的正常增生是促進窗口期子宮內膜超微結構的構建并保持一種允許胚胎種植狀態的重要環節。

米非司酮臨床應用在不斷被挖掘，但作用機理尚不夠深入，本研究在大鼠妊娠1 d后給予不同劑量的米非司酮，觀察妊娠4.5 d的大鼠胚胎種植窗口期αvβ3，VEGF基因在子宮內膜中的表達，大鼠血清雌激素、孕激素的含量，以及對窗口期子宮內膜超微結構的影響。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

米非司酮由深圳市資福藥業有限公司生產，批準文號: 國藥準字H20055518，批號: 141004。手提式高速分散器(中國, 寧波新芝, S10)、紫外可見分光光度計(中國, 上海奧譜勒儀器, UV-752P)、紫外透射分析儀(中國，Hema, UV-3A)、數顯恒溫水浴鍋(中國，江蘇環宇科學儀器，HH-4)、冷凍高速離心機(中國，Hema, TGL-16R)、基因擴增儀(中國，Hema，Hema9600)、Real-time Quantitative PCR(美國，Bio-Rad，MiniOpticon)、Trizol(美國，MRC，TR118-500)、M-MLV Reverse Transcriptase(美國，Promega, M1705)、GoTaq?qPCR Master Mix(美國，Promega，A6002)。

1.2 實驗動物與環境

SPF級Wistar近交系雌雄性大鼠各36只, 體質量180～220 g，購自中山大學實驗動物中心[SCXK(粵)2011-0029]，飼養于中山大學實驗動物中心(北校)屏障環境動物實驗設施[SYXK(粵)2012-0081]。

1.3 實驗方法

1.3.1 妊娠判斷 將25只雄鼠與25只雌鼠合籠，于第2日上午檢查陰栓，以在雌鼠陰道見到陰道栓或陰道分泌物涂片在光學顯微鏡下觀察到精子確定妊娠。

1.3.2 實驗分組 將妊娠Wistar大鼠分為3組, 1組服用5 mg/kg劑量的米非司酮(8只), 2組服用10 mg/kg的米非司酮(8只)，3組為空白妊娠組(9只)，另設空白未妊娠組(11只)，1、2組模型大鼠妊娠1d后分別服用米非司酮，在妊娠4.5 d麻醉取材觀察。

1.3.3 檢測方法 用質量分數20%烏來糖溶液按0.6 mL/100 mg腹腔注射麻醉大鼠后，取子宮組織于質量分數2.5%戊二醛中固定，在JEM-1400的透射電鏡下觀察，其血清用ELISA 方法進行雌、孕激素的測定, 同時運用實時熒光定量PCR技術檢測αvβ3、VEGF基因在在位內膜組織中的表達，目標基因的相對表達量計算公式為: 2-△△Ct= 2-[(△Ct)處理組 - (△ Ct)對照組], 其中, △△ Ct =(△ Ct)處理組- (△Ct)對照組, 表示處理組相對對照組進行歸一化, 2-△△Ct表示處理組相對對照組的相對表達量。

引物分別為

VEGF正向: TTCATGGACGTCTACCAGCG;

VEGF 反向: CTTCATCATTGCAGCAGCCC;

αvβ3正向: CTGGACTGGCTACTACTGCA;

αvβ3反向: ATGTAGCTTTCCCCGGTTGA

1.4 統計方法

2 結果

2.1 子宮內膜透射電鏡觀察

空白未妊娠組子宮在位內膜黏膜上皮細胞形態規則均一致呈低柱狀 (圖1B)，排列整齊, 層次清晰，細胞核位于基底位，核質分布均勻，高爾基體及線粒體散在分布于分泌細胞中; 上皮細胞間隙緊密, 黏膜上皮主要由少量纖毛細胞和大量分泌細胞組成，質頂部可見電子致密顆粒，分泌細胞游離面可見短小微絨毛, 呈板層狀，排列整齊(圖1A)。空白妊娠組在位內膜黏膜上皮細胞也呈低柱狀，且胞質內有豐富的線粒體，多為卵圓形; 基質細胞長梭形，細胞核大，呈不規則長管狀，胞質較少，核漿比例大; 細胞內線粒體數量較多，體積較小，內質網、高爾基體均較空白未妊娠組發達(圖1B)。

米非司酮5 mg/kg劑量組在位內膜黏膜上皮細胞呈柱狀, 形態較規則, 基底膜完整, 較彎曲; 上皮細胞緊密連接，分泌細胞游離面微絨毛短小, 腺腔可見少量脫落的微絨毛; 胞質內電子致密顆粒散在分布、脂滴少; 胞質內線粒體、內質網較豐富并具有一定的空泡化但無內含物(圖1C); 細胞核較不規則,核膜可見大小不等的切跡，核染色質均勻。

米非司酮10 mg/kg劑量組子宮在位內膜黏膜上皮細胞呈高低不齊的柱狀，細胞排列不規則，基底膜彎曲; 上皮細胞縫隙連接，分泌細胞游離面微絨毛短小，腺腔可見大量脫落的微絨毛(圖1D); 胞質內電子致密顆粒少見，可見豐富脂滴(圖1E); 細胞核不規則,核膜內陷核膜有缺裂,核質周圍邊集化，呈鋸齒狀; 胞質內線粒體部分空泡化并有內含物，且大部分脊已斷裂、內質網擴張明顯(圖1F)。

2.2 血清激素含量

雌激素含量四個組別比較差異無統計學意義(P＞0.05)(表1)。而米非司酮能夠下調妊娠大鼠孕激素含量, 且劑量效應明顯(P＜0.05 或P＜0.01)(表1)。

2.3 子宮內膜基因表達

圖1 大鼠子宮組織超微結構觀察

表1 各組大鼠血清雌、孕激素含量

與空白妊娠組比較, 5 mg/kg米非司酮組αvβ3基因表達差異無統計學意義(P＜0.05), 10 mg/kg米非司酮能夠明顯下調妊娠大鼠αvβ3基因表達(P＜0.05)。5 mg/kg、10mg/kg米非司酮組均可下調妊娠大鼠VEGF基因表達，劑量效應明顯(P＜0.05或P＜0.01)(表 2)。

表2 各組大鼠子宮內膜αvβ3、VEGF基因相對表達

3 討論

本研究中10 mg/kg劑量的米非司酮能同時下調Wistar大鼠窗口期孕激素含量、αvβ3以及VEGF表達, 嚴重損害子宮內膜的超微結構。5 mg/kg劑量的米非司酮對孕激素、VEGF有下調作用, 但對αvβ3的作用不明顯, 對子宮內膜超微結構有輕微損害, 其三者的下調及子宮內膜的超微結構的改變與米非司酮具有明顯的劑量依賴關系。米非司酮對VEGF、αvβ3的影響, 前者較后者敏感, 而本研究中 Wistar大鼠窗口期的雌激素水平沒有出現下調現象。

子宮內膜在接受胚胎種植的窗口期, 要發生充血、增厚、上皮增生、子宮腺體分泌逐漸增強等變化，促使窗口期子宮內膜變化的因素主要有子宮母體激素、子宮內膜容受性、胚泡激素、胚激肽等。孕激素具有促使子宮內膜分泌，以利受精卵植入; 米非司酮與子宮內膜中的孕激素受體高親和力結合，其影響子宮內膜的孕激素受體表達[8], 競爭性阻斷了孕激素的作用，其作用機制為米非司酮與孕激素受體結合后, 并不阻斷受體與熱休克蛋白的解離，也允許受體二聚化并與DNA結合, 但米非司酮不能激活孕激素受體的激素結合區( HBD) 上的轉錄活化因子，因而不發揮黃體酮的活性效應[9-11]，從而競爭性抑制孕激素的作用，這樣使孕激素減少。本研究中5 mg/kg、10 mg/kg劑量的米非司酮均導致大鼠孕激素含量下降，且隨著劑量的增加下降越明顯，大鼠胚胎種植期的子宮內膜增生失去孕激素的支持。

最近研究表明[12], VEGF和整合素αvβ3是參與子宮內膜血管生成的重要生長因子，其中，VEGF可以通過受體VEGFR2 /KDR 刺激內皮細胞活化，降解基底膜使內皮細胞增殖形成新的血管。而整合素αvβ3位于細胞膜，作為一種信號受體能夠誘導蛋白酪氨酸磷酸化以傳遞細胞信號，參與VEGF 誘導的血管生成進一步支持血管生成[8]。二者在血管生成的過程中起著協同作用。在子宮內膜中，血管中的血液起著輸送營養以及各種生物信號肽的作用，一旦整合素αvβ3以及VEGF 基因的表達量下降，會導致子宮內膜血管生成受阻，影響窗口期子宮內膜組織正常形態變化。本研究中米非司酮有下調子宮內膜 VEGF、αvβ3的表達作用, 與趙軒等[13]臨床報道的米非司酮有抑制VEGF產生，抑制內膜螺旋動脈的血管生長等作用相吻合。

本研究通過透射電鏡對米非司酮組窗口期子宮內膜的觀察，顯示米非司酮明顯破壞子宮內膜的超微結構功能，子宮位內膜組織有著不同程度的損傷改變, 5 mg/kg劑量組損害較輕，僅表現為少量絨毛脫落，線粒體少量空泡化，胞質有少量脂滴；10 mg/kg劑量組胞質內線粒體空泡化、內質網擴張明顯，核膜內陷有缺裂、核質著周圍邊集化，胞質有脂滴增多等等，子宮內膜的改變除VEGF 基因的表達量下降，導致新生血管生成困難外，另一原因可能源于米非司酮對內膜的抗增殖作用, 以減少內膜的血管生成及子宮血流下降, 使內膜動脈萎縮,內膜變薄妊娠困難。有學者報道[14]，米非司酮可增加內源性前列腺素(PG)的合成，而PG具有強大的收縮子宮平滑肌和血管平滑肌的作用，使子宮肌及血管收縮。同時，米非司酮還可通過阻斷孕激素受體,降低血液中-氧化氮(NO)、腎上腺髓質素(ADM)、降鈣素基因相關膚(CGRp)這三種具有強大擴管作用的血管活性物質的合成[14]，從而減弱孕激素擴血管作用,使子宮血管收縮，最終導致在位子宮內膜的超微結構的改變[15]。本研究表明，αvβ3、VEGF以及孕激素是大鼠子宮內膜超微結構的構建和維持的重要影響因子，三者的下調，在雌激素沒有顯著變化情況下，仍能引起大鼠子宮內膜超微結構的改變。推測在雌激素不變的前提下，孕激素的降低，導致雌孕激素比列的失調也可能是影響子宮內膜超微結構改變的重要原因。

VEGF 是許多腫瘤血管生成的核心，主要由多種組織細胞分泌，分布廣泛，在腫瘤細胞增殖、凋亡、淋巴道轉移等過程中起著至關重要的作用。腫瘤的生長及轉移的關鍵步驟是新生血管的形成。整合素可以加快腫瘤新生血管內皮細胞的運動，促進腫瘤新生血管的形成[16,17]，Hosotani 等[18]研究顯示αvβ3整合素的高表達有促進胰腺癌侵襲生長及遠處遷徙轉移等生物學行為，二者對促進腫瘤組織新生血管形成起到協同作用。

目前, 米非司酮作為孕激素的受體拮抗藥物, 婦產科臨床治療應用廣泛, 如: 終止早期妊娠[19]、緊急避孕和功能性子宮出血[20]、子宮內膜異位癥[21]、子宮肌癌[22]、腦膜瘤[23,24]等疾病的治療，但其治療子宮肌癌、腦膜瘤等疾病作用機理的實驗驗證尚不深入。米非司酮對子宮肌瘤的治療，主要觀點認為米非司酮是雌性激素的競爭性抑制劑，可以與孕酮受體結合[25], 然而本研究表明, 米非司酮不僅僅是降低孕激素, 5 mg/kg劑量的米非司酮能降低子宮內膜組織VEGF的表達，10 mg/kg劑量的米非司酮能同時降低VEGF、αvβ3整合素的表達，阻止了子宮內膜新生血管的生成，可能是其治療子宮內膜異位癥、子宮肌瘤、腦膜瘤的重要作用機理之一。而米非司酮對VEGF、αvβ3的下調作用，是否可成為阻斷腫瘤轉移的藥物，還有待進一步研究。

[1] Kim M, Carman CV, Springer TA. Biodirectional transmemnbrane signaling by cytoplasmic domain separation in integrins[J]. Science, 2003, 301(5640):1720-1725.

[2] Bauer SM, Bauer RJ, Velazquez OC, et al. Angiogenesis,vasculogenesis, and induction of healing in chronic wounds[J]. Vasc Endovascu-lar Surg, 2005, 4:293-306.

[3] Carano RA, Filvaroff EH． Angiogenesis and bone repair[J].Drug Discov Today, 2003, 21:980-989.

[4] Oxboel J, Binderup T, Knigge U, et al. Quantitative geneexpression of the tumor angiogenesis markers vascular endo thelial growth factor, integrin alphaV and integrin beta3 in human neuroendocrine tumors[J]. Oncol Rep, 2009, 3:769-775.

[5] 王成偉, 龐琦, 張瓏, 等. 人腦膠質瘤中微血管密度和血管內皮生長因子表達的意義[J]. 癌癥, 2004, 3:326-327.

[6] Senger DR, Gallis J, Dvorak AM, et al. Tumor cells secrete a vascular permeability factor that promote accumulation of ascites fluid[J]. Science, 1983, 219(4587):983-985.

[7] 劉桂君, 陳國江, 黎燕, 等. 血管內皮生長因子在腫瘤生長轉移中的作用機制研究進展[J]. 國際藥學研究雜志, 2012,39(5):391-395.

[8] Hayashi A, Tanabe A, Kawabe S, et al. Dienogest increases the progesterone receptor isoform B/A ratio in patients with ovarian endometriosis[J]. J Ovarian res, 2012, 5(1):31-38

[9] 陸葉, 于麗, 陳春玲. 雌、孕激素和米非司酮對子宮內膜癌細胞的作用[J]. 北京大學學報, 2005, 37(5):284-286.

[10] Barrier BF. Immunology of endometriosis [J]. Clin Obstet Gynecol, 2010, 53(2):397- 402.

[11] Lessey BA, Lebovic DI, Taylor RN. Eutopic endometrium in women with endometriosis: ground zero for the study of implantation defects[J]. Semin Reprod Med, 2013, 31(2):109-124.

[12] Zachary I. VEGF signalling: integration and multi-tasking in endothelial cell biology[J]. Biochem Soc Trans, 2013, 31(1):1171-1177.

[13] 趙軒, 吳華真, 王寶金, 等. 米非司酮對子宮內膜異位癥患者在位及異位子宮內膜中血管內皮生長因子表達及微血管密度的影響[J]. 中華婦產科雜志, 2005, 40(4):277-278.

[14] Gangula PR, SuPowit SC, Wimalawansa SJ, et al. Caleitonin gene-relatedEPtide in a depressor in N(G)-vitro-L-arginine methylester induced hypertension during preaney[J].Hypertension, 2012, 29(lptZ):248-253.

[15] Reinseh RC, Murphy A, Morales AJ, et al. The effect of RU-486 and leuprolide acetate on uterine blood flow in fibroid uterus: a prospective Randomized study[J]. Am J Obstet Gynecol, 2014, 170(1):1623-1627.

[16] Serini G, Valdembri D, Bussolino F. Integrins and angiogenesis:asticky business[J]. Exp Cell Res, 2006, 312(5):651-658.

[17] Matou S, Colliec-Jouault S, Galy-Fauroux I, et al. Effect of anoversulfated exopolysaccharide on angiogenesis induced by fibroblastgrowth factor-2 or vascular endothelial growth factor in vitro [J].Biochem Phamacol, 2005, 9(5):751-759.

[18] Hosotani R, Kawaguchi M, Masui T, et al. Expression of integrinαvβ3 in pancreatic carcinoma: relation to MMP-2 activation andlymph node metastasis[J]. Pancreas, 2002, 25(2):e30-35.

[19] 謝杏美, 王玉霞. 米非司酮配伍米索前列醇治療稽留流產和終止10～16周妊娠的效果比較[J]. 實用婦產科雜志,2012, 28(8):693-695.

[20] 王婷. 米非司酮對子宮內膜作用的研究進展[J]. 現代婦產科進展, 2013, 12(4):295 -297.

[21] 馬成斌, 劉平, 曹美良. 盆腔子宮內膜異位癥術后應用不同劑量米非司酮治療的療效觀察[J]. 實用婦產科雜志,2012, 23(1):61-63.

[22] 韓兆忠, 劉茜, 鄭偉然. 桂枝茯苓膠囊聯合米非司酮治療子宮肌瘤臨床療效和安全性的系統性評價[J]. 中醫藥現代化, 2016, 18(3):543-551.

[23] 張恒柱, 武永康, 李耀華, 等. 米非司酮對人腦膜瘤治療作用的實驗研究[J]. 中華神經外科雜志, 2005, 21(1):51-54.

[24] 劉桂君, 陳國江, 黎燕. 血管內皮生長因子在腫瘤生長轉移中的作用機制研究進展[J]. 國際藥學研究雜志, 2012,39(5):391-395.

[25] 趙公平, 劉興, 王夢溪. 米非司酮治療多囊卯巢綜合征的療效觀察(附臨床病例96例) [J]. 中華婦科雜志, 2008, 10(3):22-23.

Effects of Mifepristone on Expression of Integrin αvβ3and Vascular Endothelial Growth Factor in Wistar Rats at Implantation Window Phase

TANG Bin, LI Fu-rong, FU Xing-Lu, JIANG Guo-Jian, ZHAO Yong, ZHANG Wei
(Laboratory Animal Center of Sun Yat-sen University, Guangzhou 510080, China)

ObjectiveTo investigate the effect of mifepristone on the expression of integrin αvβ3and vascular endothelial growth factor (VEGF) gene, and the effect on ultrastructure of endometrium at implantation window phase in Wistar rats.MethodsThirty-six Wistar rats were divided to four groups,the rats of two experimental groups were orally administered with 5 mg/kg, 10 mg/kg of mifepristone respectively one day after conception. The endometrium was collected 4.5 days after mate both in two experimental groups and two control groups. Ultrastructure of the endometrium were observed by transmission electron microscope, and the expression of integrinαvβ3andVEGFgene in endometrial were tested by RT-PCR method, meantime, the contents of estrogen and progesterone in serum were detected by ELISA technique.ResultsMifepristone can inhibits the expression of integrin αvβ3, VEGF and progesterone, and increase the content of estrogen (P＞0.05). The down-regulation of the three factors and the changes of the ultrastructure of endometrium has obvious dose-response relationship with mifepristone.ConclusionThe expression of integrinαvβ3andVEGFgene were decreased differently by mifepristone as well as the content of progesterone, eventually it will affect the ultrastructure of endometrium.

Mifepristone; Integrin αvβ3; Vascular endothelial growth factor (VEGF); Estrogen;Progesterone

Q95-33

A

1674-5817(2017)05-0399-06

10.3969/j.issn.1674-5817.2017.05.011

2017-04-20

廣東省科技基礎條件建設項目(No. 2012B060300015)

唐 彬(1989-), 男, 碩士, 主要從事實驗動物研究。E-mail: 761284837@qq.com

張 薇(1964-), 女, 碩士, 高級實驗師, 從事中西醫結合基礎和實驗動物研究工作。E-mail: zwygqj@163.com