超促排卵后不同取卵時間對昆明小鼠卵子質量、體內成熟率和體外受精率的影響

彭禮繁, 張小建, 廖梅旭, 李曉潔, 余 鯤

(四川省人民醫院城東病區 輔助生殖醫學中心, 成都 610072)

超促排卵后不同取卵時間對昆明小鼠卵子質量、體內成熟率和體外受精率的影響

彭禮繁, 張小建, 廖梅旭, 李曉潔, 余 鯤

(四川省人民醫院城東病區 輔助生殖醫學中心, 成都 610072)

目的 提高超促排卵KM小鼠卵子質量、體內成熟率和體外受精率。方法 對100只KM小鼠進行超促排卵，并觀察超促排卵后獲得卵子的卵核與第一極體位置及卵周隙變化、卵子形態、卵子體內成熟率和體外受精率。結果 注射人絨毛膜促性腺激素 (hCG)后12 h、14 h取卵，卵子質量最好; 注射hCG后13 h所取卵的體內成熟率和體外受精率最高。結論 KM系小鼠體外受精的最佳取卵時間為超促排卵后13 h。

小鼠; 超促排卵; 取卵時間; 卵子質量; 體內成熟率; 體外受精率

近年來，許多研究者[1～4]相繼報道了關于各品系實驗小鼠的保種方法。其中利用胚胎冷凍方法對基因工程小鼠、自然突變模型小鼠和部分稀有品系小鼠進行保種，不失為一種方便、經濟的技術。該方法既省去了保種所需的大量資金和空間，又避免了動物飼養和繁衍所帶來的繁瑣勞作。最重要的是，這種方法保證了每一個動物品系原有的遺傳學性狀，并免受自然災害、微生物感染和環境變化所帶來的“滅頂之災” 。要使小鼠的胚胎保種取得較高經濟效益，關鍵之一在于從最少的動物個體中獲得最多的可利用胚胎，那么超促排卵-體外受精就是一種切實可行的方法。影響體外受精成功率的因素如培養液、動物年齡、超促排卵、精子質量等，其中最先涉及到的就是超促排卵和取卵。要獲得大量的具有受精能力的成熟卵母細胞，其關鍵在于超促排卵的激素劑量和取卵的時間，這些直接影響到體外受精的效率[2]。本文就小鼠超促排卵后的不同取卵時間對卵子質量、體內成熟率和體外受精率的影響進行比較分析。

1 材料與方法

1.1 動物來源

30日齡清潔級雌性KM小鼠100只，14周齡雄性KM小鼠10只，均購自四川省人民醫院實驗動物中心[SCXK(川)2014-0017]; 動物飼養于屏障飼育室[SYXK(川) 2013-0102]，室溫25～28℃，相對濕度70%，自由采食及飲水。

1.2 儀器與試劑

CO2培養箱(B5060UV,英國RSBiotech公司); 倒置顯微鏡及顯微操作系統(DMIRB, 德國 徠卡公司);熒光顯微鏡(VANOX 1000X, 日本 Olympus公司); 生物顯微鏡附照相系統(JVC KY-1900E, 日本Olympus公司); 35 mm培養皿(Faclon, 美國Corning公司); 移液器、礦物油(瑞典Vitrolife公司); 人輸卵管液(HTF); M16和 M2胚胎培養液(自配); 孕馬血清促性腺激素(PMSG)和人絨毛膜促性腺激素(hCG)均購于寧波第二激素廠。

1.3 方法

1.3.1 分組 將30日齡KM雌鼠分別隨機分成20組,每組各5只。14周齡雄性KM小鼠分別隨機分成2組,每組各5只。

1.3.2 超促排卵與取卵 每只小鼠腹腔注射PMSG 5 IU，間隔48 h后再腹腔注射hCG 5 IU，其后12～18 h內按間隔1 h分組依次取卵，取得的卵母細胞移入200 μL HTF微滴中培養。

1.3.3 體內成熟率的觀察 超促排卵后的卵母細胞排出第一極體作為成熟的標志[成熟率(%)=排除第一極體卵數/總卵數]。

1.3.4 精子的獲取與體外受精 按照彭禮繁等[16]方法獲得小鼠的精子，放入預先平衡過夜的受精液滴中。培養箱箱孵育5 min后，取10～30 μL精子懸液，移入另一新鮮液滴，調整精子濃度達1.0×106個/mL，培養條件為37 ℃，體積分數6%CO2、體積分數5%N2、飽和濕度，獲能5～7 h[17～19]。1.5 h后選擇濃度適中、活力佳的精子懸液進行體外受精。將授精的卵母細胞團放在CO2培養箱中培養，6 h后洗卵，再培養過夜。

1.3.5 受精結果的檢查 受精培養12 h后將卵子移出，放入含體積分數0.1%透明質酸酶的M2中，用移液槍進行小心反復吹打以去除附著在卵子周圍的卵丘細胞，然后用M2再洗5～6遍。將去除卵丘細胞的裸卵放在顯微鏡下觀察，凡見到2原核、第二極體及胞質或卵周隙中有精子尾的均判斷為受精。整個洗卵過程中所用洗卵液均為37 ℃預熱，操作過程要迅速，盡量減少卵母細胞在外周環境中的停留時間。最后移入預先過夜平衡的M16中培養，24 h后觀察2細胞發育情況、2-細胞胚胎數、未受精卵數、異常卵數和取卵總數，統計受精率和異常卵比例，同時觀察細胞形態。

1.3.6 卵核的觀察 從壺腹部收集的體內成熟卵母細胞，放入質量分數3%的蔗糖溶液中5 min后，在倒置顯微鏡下觀察到折光性不同的區域為卵核所在位置[16]。

1.4 統計學分析

2 結果

2.1 注射hCG后不同取卵時間對卵核與第一極體位置及卵周隙變化的影響

從表1中可以看到，注射hCG后12 h、14 h取卵時，卵核與第一極體在0～30°區域毗鄰的卵母細胞率(91.3%、91.5%)顯著高于其它處理組(P＜0.05); 注射hCG后20 h、22 h取卵時，卵核與第一極體在30～90°區域毗鄰的卵母細胞率(40.8%、42.3%)顯著高于其它處理組(P＜0.05); 注射hCG后24 h、26 h取卵時, 卵核與第一極體在90～180°區域毗鄰的卵母細胞率(63.4%、61.7%)顯著高于其它時間段(P＜0.05)。從注射hCG后10 h取卵時的10.1μm, 增加到26h取卵時的19.9 μm。可見, 注射hCG后12 h至14 h取卵, 卵子質量最好。

2.2 注射hCG后不同取卵時間對KM小鼠的卵子體內成熟率和體外受精率的影響

由表2結果可以看出，在超促排卵后13 h取卵的體內成熟率和受精率最高；13 h異常卵比例最低，而18 h受精率最低、異常卵比例最高。KM小鼠超促排卵后不同取卵時間的體外受精率均呈現相同的趨勢: 隨著取卵時間的提前或延遲，受精率逐漸降低。觀察異常卵的形態，可見在超促排卵后14 h取的卵中，異常卵均為發育異常。超促排卵后13 h取的卵細胞較多，12 h取的卵細胞最少。

表1 注射hCG后不同取卵時間對卵核與第一極體位置及卵周隙變化的影響Table 1 Effect of different in vivo maturation time after HCG on location between oocyte caryoplasm and first polar body change of perivitelline space

表2 KM 小鼠的卵母細胞形態和體外受精率的變化Table 2 Morphology of oocytes and IVF rate for KM mouse

3 討論

在研究第一極體出現與退化時間變化時, 本試驗表明，小鼠體內成熟的卵母細胞在注射hCG后10 h時沒有第一極體排出, 但到hCG處理后12 h開始有12.8%的第一極體排出, 到hCG處理后14 h第一極體的排出率達到最大, 即91.5%。Alcobia等[2]研究表明, 在注射hCG處理后10～14 h取卵, 小鼠的卵母細胞多數處于第一次減數分裂后期。Alcobia等[3]研究表明, 對于CBA小鼠在注射hCG后11 h取卵時, 大多數卵子都排出第一極體。Armstrong等[4]在注射hCG后14 h取卵，只有約10 %的第一極體開始移動，但到極體排出后2 h，即注射hCG后14 h時，只有10 %的卵核處于第一極體的下方，其余的卵核都分布于卵母細胞的其它區域，這與本試驗結果在注射hCG后16 h有70.4 %的第一極體處于0～3 0°區域的結論不同。

Cremer等[5～10]研究表明，體內成熟的卵母細胞中第一極體移動的要比體外成熟的卵母細胞要快。他們認為對于體內成熟的卵母細胞，可能是由于脫卵丘促進了第一極體的移動，因為對于體外成熟的卵母細胞是在脫完卵丘細胞后才進行培養的。極體的移動是一個時間與卵周隙的依賴過程，卵周隙會隨著取卵時間的延長而逐漸增大，而卵周隙的增大會促進極體的移動。以下的結果可以證實作者的解釋：①體內成熟的卵母細胞在體外老化過程中卵周隙都會在增大，而且卵周隙與極體處于0～30°的比例間具有很高的相關性; ②排卵過程會促進第一極體的移動; ③極體排出后脫卵丘細胞后會促進極體的移動，而老化后脫卵丘細胞會更加促進極體的移動。該過程可能涉及到卵母細胞皮質區的微絲。因此，第一極體的移動可能是由于卵周隙逐漸增大的緣故，本試驗結果也證實了該點。

本實驗證明, 超促排卵后取卵時間的差異會對體外受精產生顯著影響，并直接關系到正常胚胎的獲得數。對于小鼠體外受精的取卵時間, 多數文獻只給出了一個大致時間范圍[11,20]。但從本實驗結果可看出，在這些時間范圍內取的卵其受精率之間也有著明顯差異。超促排卵后13 h、14 h 取卵的兩組，受精率最高，且兩組間無明顯差異(P＞0.05);但結合總取卵數和異常卵比例來看，超促排卵后13 h取卵的異常卵比率最低而且取卵數最多。所以，在超促排卵后13 h取卵進行體外受精是最佳時間，這與左琴等[20]報道是一致的。取卵時間過晚會使受精率大大降低，14 h所取卵的受精率明顯高于15 h以后所取的卵(P＜0.01)。因為卵母細胞在體內發育成熟后若不能及時受精便開始衰退，逐漸喪失受精能力。取卵時間過早，獲得的卵母細胞中有一部分還未完全發育成熟，受精能力較低，而且在體外培養過程中容易死亡，影響體外受精率。在體外受精過程中會產生部分異常卵，這是由于卵母細胞多精子受精或孤雌發育造成的，實驗結果顯示這些異常卵對體外受精率并無多大影響。而死亡卵和退化卵則大大影響了體外受精率，只要控制好超促排卵后的取卵時間，它們的產生也是可以避免的[12]。

造成超促排卵效果不穩定的因素主要有三大類:一類是動物因素, 包括開始超促排卵的時間、發情同步方法、遺傳因素、營養狀態等。因此, 要選擇健康、體質量適中的動物。如果雌鼠體質量過大, 不易與雄鼠交配，而雌鼠過小，其發育尚未成熟，超促排卵效果不佳。第二類是藥物因素, 包括激素的半衰期、激素種類、激素藥效，及激素的比例、給藥途徑、多種激素的聯合應用與劑量、頻率等。第三類是影響動物的各種環境因素和人為因素等，如室溫應在22～26 ℃，濕度應保持在50%～70%。不適的溫濕度條件會影響其配種與受胎率，并影響卵子的數量和質量。配種與胚胎回收方法的選擇也對超促排卵效果也有直接影響[14]。

要讓體外受精這門胚胎技術在實驗動物的保種和轉基因動物的繁育上發揮其方便、經濟、有效的特性，除了選擇培養基、改進操作方法外，嚴格控制取卵時間也顯得尤為重要[15]。控制適當取卵時間是體外受精的關鍵之一，但在整個實驗過程中，依然會遇到一些對受精率有影響的操作環節，例如授精時間、培養液的酸堿度和滲透壓、精子濃度和質量等，而且小鼠品系間的差異也會對胚胎實驗產生一定的影響，這有待于在今后的實驗中做進一步研究。

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Different Oocyte Collecting Time Impact on Quality of Oocyte,in Vivo Maturation Rate and in Vitro Fertilization Rate after Superovulation in KM Mice

PENG Li-fan, ZHANG Xiao-jian, LIAO Mei-xu, LI Xiao-jie, YU Kun
(Reproduction Medical Center, Sichuan Provincial People's Hospital East Ward, Chengdu 610072, China)

ObjectiveTo improve the quality of oocyte,in vivomaturation rate andin vitrofertilization rate in KM mice.MethodsOne-hundred KM mice were super-ovulated, the changes of the oocyte nucleus and the first polar body position, the perivitelline space changes, oocyte morphology,in vivomaturation rates andin vitrofertilization rates were observed and calculated.ResultsThe oocyte quality was best after 12 h、14 h of injection with human chorionic gonadotropins (hCG), and oocyte in vivo maturation rate and in vitro fertilization rate were the highest after 13 h.ConclusionCollection of oocyte after 13 h of superovulation was the best time forin vitrofertilization of KM mouse.

Mice; Superovulation; Collecting oocyte time; Oocyte quality;In vivomaturation rate;In vitrofertilization rate

Q95-33

A

1674-5817(2017)05-0405-05

10.3969/j.issn.1674-5817.2017.05.012

2017-04-17

四川省科技廳軟科學項目(2017ZR0060)

彭禮繁(1982-), 男, 碩士, 助理研究員, 研究方向: 輔助生殖胚胎學。E-mail: penglf_syau@126.com