植物抗性基因NPR1研究進展

韓永光，馬利剛，趙 樂，馮衛生，鄭曉珂*

(1.河南中醫藥大學藥學院，河南鄭州 450046；2.呼吸疾病診療與新藥研發河南省協同創新中心,河南鄭州 450046)

病程相關基因非表達子1 ( nonexpressor of pathogenesis-related genes 1，NPR1)是多個抗病性信號傳導通路的交叉點，是調節植物整體抗病性的重要作用因子，又稱為NIM1 或SAI1。植物如果缺少NPR1的功能，就會導致病程性相關蛋白質PR基因表達的受損和在應對病蟲害侵害時，系統性獲得抗性 (Systemic Acquired Resistance，SAR)的抵抗作用幾乎全部缺失。通過對DNA序列進行比對分析，結果顯示NPR1啟動子中含有相對保守的28個核苷酸序列，這些序列組成3個W盒，其中1個反向排列，2個順向串聯。NPR1啟動子必需與WRKY蛋白結合后才能發揮作用，如果W盒中的某個核苷酸被替換，則不能與WRKY 蛋白發生結合[1]。NPR含有多個錨蛋白重復序列和1個BTB/POZ區，NPR1在細胞核內主要是負責SA-介導PR-1基因的誘導表達，而其在細胞溶質中主要在SA和JA信號通路中發揮重要的拮抗作用[2]。

在細胞溶質中NPR1通過氨基酸順序的第82和216位半胱氨酸殘基分子間的二硫鍵結合形成寡聚體，可通過硫氧還蛋白H5或H3還原2個半胱氨酸殘基(Cys82和Cys216)調控細胞液中的氧化還原狀態，NPR1低聚物二硫鍵迅速被還原, 形成單體。NPR1單體隨后由細胞溶質轉移到細胞核中，在核中激活防御基因的轉錄。突變這2個半胱氨酸中的任何一個都能導致核定位單體NPR1水平的升高，而核定位單體NPR1與不斷上調PR基因的表達密切相關[3]。

1 NPR家族

最新研究表明NPR蛋白家族包括研究相對多的NPR1和另外5個可能編碼NPR 1相關基因(NPR2-6)，其共同點是均含有保守BTB / POZ、錨蛋白的相關蛋白重復結構域和高度保守半胱氨酸殘基。NPR3是免疫信號SA的受體，可作為泛素E3配體的調節器，以一種SA調節的方式調控npr1的降解。npr3突變體積累了較高水平的npr1，對SAR誘導不敏感。該突變體在病原體效應誘發細胞程序性死亡和免疫方面存在缺陷[4]。NPR4與NPR1具有36%的同源性，并與轉錄因子TGA相互作用。NPR4 mRNA水平的表達量會隨病原體的侵入和SA的處理而激增，但JA的處理則會導致其表達水平的下降， NPR4主要在抗病原體的基礎防御起到必需的作用，而且它可能與SA和JA依賴的信號通路之間的交叉通路有關[5]。NPR5又稱為BOP1 ，BOP1能編碼一個具有錨蛋白重復序列的BTB/POZ 域的蛋白。BOP1屬于一類小基因家族成員，其中包括比較典型的抗病調節蛋白NPR1。 BOP1在調控葉片形態形成和分化起關鍵作用[6]。NPR6又被稱為BOP2，BOP2同樣能調節葉片的發育，最新研究表明BOP2能通過減少PHYTOCHROME INTERACTING FACTOR 4(PIF4)蛋白水平，促進光生形態的形成，并通過抑制PIF4活性來調節熱形態發生[7]。NPR2功能研究尚不清楚，有文獻表明NPR2與NPR1序列相似性高，功能類似，同樣對SA比較敏感[8]。

2 NPR的抗性

通過轉基因技術手段將NPR1基因轉入到擬南芥突變體npr1后，突變株不僅能在表型上有所改觀，其SAR的能力也得到恢復，PR基因的表達和植物的抗性能力得到增強。即使在無誘導的條件下，同樣具有很強的抗性能力[9]。有文獻表明在NPR1基因的過量表達植株具有增強植物的抗病能力，且無其他不良的負效應[10]。Chern等[11]在過量表達擬南芥NPR1基因的水稻中證實NPR1基因在單子葉植物中所扮演的作用，發現轉基因水稻植株能提高對水稻細菌性枯葉病原體的抗性能力，而且RNA點雜交試驗表明NPR1基因的高表達能提高抗病能力，首次確定NPR1基因可以提高單子葉植物的抗病能力。而過量表達NPR1基因的轉基因擬南芥和水稻中則能夠顯著地增強植株抗病性，結果表明NPR1是SAR信號轉導途徑中作用于SA下游的一個關鍵性調控因子。在SAR誘導條件下，擬南芥npr1突變體能積累正常的SA濃度, 但是不能有效地激活SAR，更不能積累PR蛋白，從而不能高效地提高植物的抗性，npr1突變體表現為對病原體更加敏感，使抗病R基因參與形成的抗病能力得到降低，表明NPR1在感染位置限制病原菌生長方面發揮重要作用。

荷蘭科學家Pieterse等[12]發現NPR1同樣在誘導性系統抗性(induced systemic resistance,ISR)中具有重要的作用。在npr1突變株中，ISR不能被ISR誘導菌Pseudomonas fluorescens誘導激發。經過SA和JA同時處理植株葉片后，SA能抑制JA相關基因的誘導表達，但在NahG轉基因植株侵染PstDC3000后，SA的含量沒發生明顯地變化，而JA水平卻增加了25倍，參與JA信號傳導途徑的相關基因表達量也顯著地增強，在npr1突變體的植株中, 這種抑制作用顯著減弱[2]。說明NPR1在SA介導的SAR和JA介導的ISR中均具有重要免疫調節作用。在jar和etr突變體中ISR防御生理過程受抑制，結果表明ISR過程需要JA和C2H4等信號參與。生態型為RLD和Ws的擬南芥中ISR受到抑制，使得擬南芥對C2H4的刺激不敏感。而eds4和eds8突變體分別對C2H4和JA的處理不敏感，ISR生理過程反應也受到抑制。但另一種eds的突變體eds10對C2H4和JA均能做出免疫反應，進而能激活SAR反應，但不能激活ISR反應。表明EDS10是ISR中一個很重要的作用因子。在整個ISR反應過程中，同時還需要位于JAR1和ETR1下游的NPR1的參與[12]。因此，可以證實NPR1是誘導SA或JA/C2H4防衛反應的一個重要的調節因子。而大量試驗表明SA的積累會導致JA的生物合成和JA調節基因表達的抑制。對野生型和SA、JA和C2H4缺失的突變體進行大規模研究分析發現，盡管SA信號轉導途徑能被JA/C2H4抑制，但SA對JA信號轉導途徑的抑制更為普遍[13]。另外發現用SA和JA處理擬南芥可以抑制JA調節的基因的表達[2]，而對npr1突變體進行研究發現SA對JA的拮抗效應需要NPR1參與。與激活SAR不同，NPR1不參與抑制JA信號轉導途徑。因此，可以說NPR1是植物防御免疫反應(包括SAR、ISR、SA/JA 交叉轉導)的關鍵調控因子。

趙利輝等[14]從多種病原真菌中分離純化出一種新的42 kD耐熱蛋白，被稱之為植物激活蛋白(plant activator protein)，研究發現其對TMV和CMV等多種植物病菌都具有一定的抗性。cDNA芯片試驗表明該蛋白可誘導NPR1和乙烯受體相關基因等抗病基因的轉錄，他們檢測該激活蛋白處理水稻葉片能引起水稻NPR1的轉錄水平顯著提高，促進抗病蛋白如PR蛋白的積累，提高其抗性。說明植物體內某些熱激蛋白也可能與NPR1發生相互作用。npr1突變體植株對SAR多種誘導介質如SA、INA均不能明顯作出抗性應答, 表現為PR基因的表達幾乎無明顯變化，而且更容易感染細菌和真菌病毒等病菌。而使用外源性SA 或人工合成的類似物質，例如IN A可使PR基因的表達得到誘導和可較強地激活SAR[15-16]。另外有研究發現NPR1基因不僅在SA介導的SAR以及根圍細菌介導的ISR中具有重要作用, 而且在抑制JA信號分子介導的防衛反應方面也發揮著重要作用。

盡管在NPR1蛋白的研究過程中發現由SA 介導SAR信號傳導途徑大多為NPR1蛋白依賴型，然而有研究發現存在一種不依賴于NPR1蛋白的信號傳導途徑。抗性擬南芥生態型Di-17植株感染蕪菁卷曲病毒(TCV)后，證實HR的形成和對TCV 抗性均依賴于SA途徑，而非依賴于乙烯和茉莉酸， 并且NPR1 基因突變不能影響這些生理過程，表明擬南芥的TCV抗性存在一條仍未確定的依賴SA而不依賴NPR1的信號轉導途徑[17]。在煙草研究證實TMV抗性是由一條依賴于SA似乎還需要交替氧化酶( Alternative Oxidase, AOX) 的介導途徑的，奇怪的是SHAM(一種AOX活性的抑制物質)可抑制TMV抗性，而不能抑制PR表達的TMV誘導性的激活抗性, 另外細菌或真菌病原體的抗性并不會受到SHAM處理的影響。因此，煙草中可能存在至少2條不同的SA調控防御途徑: 一條認為是依賴于NPR1且調控PR基因的表達以及抗細菌和病原體;而另一條可能是不依賴于NPR1也能激活病原體抗性[18-19]。Bowling等[20]篩選出來的擬南芥cpr突變株存在2種調控轉導途徑——依賴NPR1和不依賴NPR1的SAR途徑的組成表達，這種現象說明這2種調控轉導途徑在早期的信號轉導過程是相互關聯的，而且在病毒抗性方面可能存在重疊效應。

3 NPR與轉錄因子的相互作用

酵母雙雜交試驗表明與NPR1直接相互作用的蛋白主要是bZIP轉錄因子的TGA家族的多個成員，還有就是其他3種蛋白NIMIN1，2和3(NIM1-相互作用蛋白1，2和3)[21]。Zhang等[22]通過試驗證實NPR1 能與TGA 轉錄因子發生相互作用，從而調節NPR1的表達。NPR1上4個關鍵點的任何一個發生突變，均能導致NPR1 不能與TGA發生作用。而這種相互作用是調節PR基因表達所必需的，說明NRP1可能通過TGA調控PR基因的表達和增強植物的抗病能力。TGA轉錄因子是b ZIP轉錄因子家族非常重要的組成部分，其含有DNA結合域和亮氨酸拉鏈，能與順式作用元件相結合，從而調控基因的表達[23]。雖然在經過SA處理后，擬南芥中NIMIN1，2和3被誘導的相對持續時間較短，但NIMIN1表現為負調控SA/NPR1信號通路。過量表達NIMIN1導致ETI和SAR的鈍化效果。而減少NIMIN1的表達則PR-1基因的表達能通過SA得到增強[24]。在酵母中，NPR1可與5個不同的擬南芥TGA因子相互作用，而在高等植物中NPR1可與7個不同的擬南芥TGA因子相互作用[25]，而在經過SA處理的擬南芥葉片中，僅檢測到TGA1和TGA4與NPR1相互作用。這種相互作用依賴于SA誘導的氧化狀態環境的變化，從而導致TGA1和TGA4 2個特有的半胱氨酸殘基Cys-260 和Cys-266的還原。在非誘導情況下, 這2個氨基酸殘基以氧化狀態存在, 以二硫鍵結合, 防止與NPR1 結合；當SA處理誘導后, 二硫鍵被還原，使得TGA蛋白與NPR1相互作用，從而激活基因表達，增強抗性[26]。在無SA存在的情況下，TGA2也能與NPR1相互作用，但在SA處理葉片中，這一相互作用可增強[27]。然而，TGA2和TGA3激活抗病基因轉錄需要SA和NPR1。因為NIMIN1在酵母中能與TGA2、TGA6、NPR1和PR-1啟動子區域形成復合體，這一復合體可能調控TGA依賴的SA調節基因的轉錄激活[24]。

4 展望

NPR1是植物抗病性的關鍵調控轉錄因子，涉及多種抗性途徑，現已知在多種經濟作物中均含有NPR1或高度同源的基因，在植物保護中具有重要的研究價值，因此可以通過轉基因等技術工程手段將NPR基因應用于植物保護等方面，在植物抗病害等方面應用前景廣闊。實際上，科學家已經構建轉基因NPR1擬南芥和水稻等植物，對它們在抗性方面的研究也取得重要的成績。很多研究表明過量表達NPR1的單子葉或雙子葉植株均表現出對多種致病病原體具有良好的抗性，因此在減少植物病害、增加作物產量方面，NPR1具有巨大的應用潛力和研究價值。如通過構建轉基因植株，特異性高誘導NPR1的表達激活植物防御機制，誘導植物抗性。通過篩選、分離和鑒定植物的抗病突變體。同時，還可以篩選一些能夠激活植物SAR的小分子化合物；盡管科學界對NPR1的研究取得很大的進展，但是仍然有許多問題還沒有得到解決，如：SA激活NPR1基因表達是否涉及其他代謝分子，還需要進一步深入研究；不同TGA轉錄因子成員如何互相協調共同調控NPR1信號傳導途徑；NPR1如何在植物體內有機地調控不同的信號傳導途徑，將涉及SA、ET和JA的信號之間有機聯系在一起；NPR1和SA等信號途徑之間是否還存在其他不同的調控因子；NPR1結合蛋白與NPR1的相互作用機制尚不完全清楚；通過分子生物學、基因工程等多種技術手段，應該能夠獲取更多與NPR1相互作用的因子或調節基因，有助于對NPR1作用機理的了解， 為進一步研究植物抗病防治機制做貢獻。