奧希替尼治療晚期非小細胞肺癌耐藥機制研究進展

母予馨，李峻嶺

國家癌癥中心/國家腫瘤臨床醫學研究中心/中國醫學科學院北京協和醫學院腫瘤醫院內科，北京100021

第一代表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）酪氨酸激酶抑制藥（tyrosine kinase inhibitor，TKI）最常見的耐藥機制是EGFR第20號外顯子T790M突變，約占60%[1-2]。以奧希替尼為代表的第三代EGFR-TKI，還包括rociletinib、olmutinib、WZ4002、EGF816和ASP8273，能夠克服這種耐藥。奧希替尼的客觀緩解率（objective response rate，ORR）和無進展生存期（progressionfree survival，PFS）分別為61%和9.6個月[3]，但耐藥仍不可避免，其耐藥機制主要包括C797S突變，人表皮生長因子受體2（human epidermal growth factor receptor 2，HER2）和間質表皮轉化因子（mesenchymal-epithelial transition factor，MET）擴增，1-磷酸酰肌醇-3-激酶（phosphati dylinositol 3-kinases，PIK3CA）突變，第10號染色體同源丟失（phosphate and tension homology deleted on chromsome ten，PTEN），RAS基因-有絲分裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）通路激活，胰島素樣生長因子1受體（insulin-like growth factor 1 receptor，IGF1R）激活等[4]。本文將針對奧希替尼治療晚期非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）耐藥機制的研究現況加以綜述，以期為后續治療的臨床應用提供選擇依據。

1 EGFR依賴途徑

1.1 C797 S突變

EGFR-C797S突變是第三代EGFR-TKI主要的耐藥機制。奧希替尼與半胱氨酸C797在ATP結合位點形成共價鍵，C797S突變影響了共價鍵的結合，引起EGFR-TKI失去阻斷EGFR通路的作用[4]。Thress等[5]首先證實了C797S出現于非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）患者，研究分析了19例奧希替尼獲得性耐藥患者的外周血標本，發現其中6例患者出現C797S突變（32%）。Ramalingam等[6]對19例進展后患者外周血標本進行檢測，發現2例患者出現C797S突變。研究人員在臨床前研究中也證實了C797S的出現，并且發現C797S突變所在染色體的基因狀態會對后續治療起指導作用[7]：①存在EGFR敏感突變，如果C797S和T790M突變為反式結構（位于不同等位基因），則腫瘤對第三代EGFR-TKI耐藥，第三代和第一代EGFR-TKI聯合應用有效。②存在EGFR敏感突變，如果C797S和T790M突變為順式結構（位于同一等位基因），目前無論是單用第三代EGFR-TKI或者聯合第一代EGFR-TKI均無效。而Niederst等[7]的臨床前研究發現，表達C797S突變的耐藥細胞，85%與T790M呈順式結構，臨床試驗中應用奧希替尼治療后耐藥患者的基因檢測結果顯示，只有1例患者C797S與T790M呈反式結構，其余均呈順式結構[5]。因此，探索出對這組人群有效的后續治療方法至關重要，目前針對C797S突變耐藥的第四代藥物正在研發中。臨床前研究顯示，L858R/T790M/C797S三突變細胞系部分對cetuximab敏感[8-9]，但并沒有在體內研究中獲得證實，而對EGFR突變具有高度選擇性的變構抑制劑EAI045聯合cetuximab在小鼠模型中已對L858R/T790M/C797S突變產生了療效[10-12]，但對EGFR-C797S/T790M/del19導致的耐藥無效[10]。Uchibori等[13]的臨床前研究發現，brigatinib對C797S/T790M/del19三突變細胞系有效，可以減少EGFR及其下游信號通路的磷酸化，對C797S/T790M/L858R三突變也有效，但強度小于對C797S/T790M/del19三突變。Uchibori等[13]還探索了其他間變性淋巴瘤激酶（anaplastic lymphoma kinase，ALK）抑制藥，發現只有brigatinib和AP26113類似物對三突變有抑制作用并且C797S/T790M/del19對其敏感性更強，而其他ALK抑制藥如TAE684、ceritinib和ASP3026效果不佳。briga-tinib對C797S/T790M/del19三突變的抑制作用同樣在小鼠模型中得到了證實，還發現聯合應用cetuximab和 brigatinib，cetuximab能提高 brigatinib或AP26113類似物的作用，另一種EGFR抗體——panitumumab，聯合brigatinib也得到了相似的效果。③如果一線應用第三代EGFR-TKI后繼發T790M陰性、C797S陽性，腫瘤對第三代EGFR-TKI耐藥，但仍對第一代EGFR-TKI敏感[7]。Niederst等[7]和Ercan等[9]的臨床前研究顯示，一線應用第三代EGFR-TKI后可能出現的C797S+/T790M-細胞對吉非替尼或阿法替尼敏感。Godin-Heymann等[14]也發現，厄洛替尼可阻斷存在C797S突變的EGFR通路。

1.2 EGFR其他罕見突變

除了C797S，EGFR其他罕見突變也會引起奧希替尼耐藥。Zheng等[15]通過對1例奧希替尼治療患者的動態監測發現了新的EGFR耐藥位點：G796D，為了確認G796D突變對奧希替尼的耐藥作用，研究者又進行了體外試驗，發現G796D突變導致奧希替尼與C797共價結合的空間位阻。突變的D796殘基的親水側鏈CH2COOH插入奧希替尼的多脂中心結構，或者是將奧希替尼擠出目前的結合位置，或者是將結合環扭曲影響鉸鏈結合，從而影響奧希替尼與激酶區的緊密結合，產生耐藥。除此之外，研究人員在1例患者的大量胸腔積液標本中發現了另一種新的C797突變：C797G，與T790M呈順式結構，并且與灶性MYC和EGFR擴增有關[16]。還有L718Q和L844V突變，二者都能導致WZ4002和rociletinib耐藥[9,17]。而Bersanelli等[17]首次在1例臨床應用奧希替尼治療后耐藥的患者中發現L718Q突變。這些罕見突變還有待進一步研究并探索出針對性的靶向藥物。

1.3 T790M消失

不少研究發現，第三代EGFR-TKI可能導致T790M突變克隆的減少或消失，從而導致奧希替尼耐藥。Piotrowska等[18]進行的一項Ⅰ/Ⅱ期研究，選取12例應用rociletinib患者配對的治療前和耐藥后的組織活檢標本，6例患者治療后出現了T790M的消失，該6例患者中2例出現小細胞肺癌（small cell lung cancer，SCLC）轉化。Thress等[5]的研究顯示，15例患者中4例T790M陽性的患者在奧希替尼耐藥后的外周血標本中T790M消失，而EGFR敏感突變仍存在并且突變水平較前增高。Chia等[19]對2例患者治療前后組織標本進行的研究也得到相同的結果，2例患者治療前后的組織標本均來自于不同部位，可能與腫瘤進展過程中腫瘤的異質性有關。基于這些結果，T790M消失可能是第三代EGFR-TKI治療后的結果，也是耐藥原因，其出現可以單獨存在，但更多是與其他耐藥機制例如HER2擴增、MET擴增、BRAF V600E突變、PIK3CA突變并存，可能是這些細胞的過度增殖導致[6,20]。

1.4 EGFR擴增

EGFR擴增不僅是第一代EGFR-TKI的獲得性耐藥機制[1,21]，目前越來越多的研究證實其可能也是第三代EGFR-TKI的獲得性耐藥機制之一。Piotrowska等[18]的研究發現3例耐藥患者的組織標本EGFR擴增，而用藥前標本中并未出現。這3例患者仍保留了EGFR敏感突變和T790M突變。Knebel等[22]動態檢測了1例應用奧希替尼治療后耐藥的患者，在奧希替尼治療前和治療過程中每月留取外周血檢測，以探討其耐藥機制，耐藥后研究人員發現EGFR-exon19del拷貝數從141增加到4230，即選擇性EGFR-exon19del擴增，其擴增水平與臨床和影像學進展相平行。因此檢測EGFR水平或許可以早期發現獲得性耐藥。Niederst等[7]進行的體外研究也于厄洛替尼和WZ4002耐藥細胞中發現EGFR擴增，證實了這一觀點。

2 旁路途徑激活

2.1 MET擴增

關于MET擴增，Planchard等[23]首次做了相關報道，在1例應用奧希替尼10個月后肺部病灶進展的患者中發現了MET擴增（cMET/CEP7：5.32），L858R突變存在但T790M消失。Ortiz-Cuaran等[24]在1例rociletinib原發耐藥的治療前組織標本和奧希替尼治療后耐藥組織標本中均發現了高水平的MET擴增。Chabon等[25]的研究中，43例患者應用rociletinib治療，11例（26%）存在MET擴增，其中7例僅表現為MET擴增，3例合并其他基因的改變，例如PIK3CA和CDKN2A，1例合并HER2擴增，MET拷貝數增加在其研究中最為多見，與Ortiz-Cuaran等[24]的研究有相似的結果。Chabon等[25]還分析了16例治療前組織標本或外周血標本T790M陽性、MET拷貝數增加的患者，發現這組人群治療后較不存在MET改變的患者腫瘤縮小不明顯，并且中位PFS較短。這一研究表明，第三代EGFR-TKI應用前即存在MET擴增可能與其療效不佳有關。一些體外實驗也為MET擴增可能導致新一代EGFR-TKI原發和獲得性耐藥提供了證據，并證實了臨床觀察的結果[24,26-27]。

針對這一耐藥機制，聯合應用奧希替尼和MET抑制劑或許是一個選擇。1例應用奧希替尼9個月后耐藥的患者，對比用藥前和進展后的活檢檢測結果，耐藥后出現高水平的MET擴增。給予患者MET抑制劑克唑替尼單藥口服，2周后呼吸困難癥狀緩解，1個月后療效評價為疾病穩定（stable disease，SD）[28]。因此，MET擴增是奧希替尼耐藥的潛在因素，對于奧希替尼耐藥并存在MET擴增的NSCLC患者，單獨或聯合應用MET抑制劑或許會是克服這種耐藥的有效方法。

2.2 HER 2擴增

Planchard等[23]首次報道了HER2擴增可能是第三代EGFR-TKI的獲得性耐藥機制之一。1例應用奧希替尼超過12個月后耐藥的患者，其耐藥后的二次活檢肺組織標本中發現HER2擴增，同時EGFR 19缺失、T790M消失，而治療前標本中未發現HER2擴增。Ortiz-Cuaran等[24]收集了7例患者經奧希替尼（n=5）或rociletinib（n=2）治療前后的腫瘤組織標本并進行基因檢測。2例應用rociletinib的患者原發耐藥，應用奧希替尼患者中2例SD，3例部分緩解（partial response，PR），但最終都出現了疾病進展（progression disease，PD）。從用藥3周后出現大量胸腔積液的1例應用rociletinib的PD患者的胸腔積液標本及2例SD患者（奧希替尼）治療前的肺組織標本中均檢測出了HER2擴增，認為HER2擴增可能替代了EGFR信號通路，是導致患者對奧希替尼和rociletinib缺乏反應的原因。對此，Ortiz-Cuaran等[24]還進行了體外研究，證實即使HER2低度擴增也會降低NSCLC細胞對奧希替尼和rociletinib的敏感性。關于第一代EGFR-TKI的研究顯示，EGFR T790M和HER2互斥[29]，而對于第三代EGFR-TKI，Oxnard[30]對40例應用奧希替尼患者的研究中也得出了相似的結論。這些研究支持了HER2擴增或許會替代EGFR通路并導致奧希替尼等第三代EGFR-TKI耐藥。

2.3 PIK 3CA突變

PIK3CA突變占肺腺癌的2%～4%，與其他腫瘤驅動機制共存[31-32]。研究顯示，同時存在PIK3CA和EGFR突變的患者中位生存時間短，提示這種協同作用可能是由于下游信號更強的激活[31-32]。Chabon等[25]對在應用rociletinib后獲得性耐藥的5例患者的檢測中發現了兩種突變形式，E542K和E545K。其中2例患者僅表現為PIK3CA突變，3例患者還同時存在MET、EGFR、HER2基因的突變。Oxnard[30]的研究也同樣發現了PIK3CA E545K突變，提示這一突變可能是第三代EGFR-TKI耐藥的潛在因素。

2.4 PTEN缺失

PTEN缺失被認為是第一代EGFR-TKI的耐藥機制之一[33]。關于其在第三代EGFR-TKI耐藥中的作用，Kim等[34]報道了1例應用奧希替尼治療的患者，治療前存在EGFR T790M突變和PTEN缺失，治療后監測發現腫瘤細胞中PTEN缺失和EGFmRNA表達比例增加。這種緩慢增加的PTEN缺失和EGF過表達或許是該患者應用奧希替尼治療后進展的原因。

2.5 RAS-MAPK通路激活

KRAS突變被認為是第一代EGFR-TKI耐藥機制之一[35]。Ortiz-Cuaran等[24]的研究中1例應用奧希替尼耐藥的患者，血液標本中檢測出C797S突變，組織標本中檢測出C797S突變、T790M消失，并檢測到新的KRAS G12S突變，認為奧希替尼對EGFR通路的阻斷作用可能會將腫瘤EGFR信號通路減少到一定水平，從而允許KRAS突變細胞的出現。這一觀點也得到了Hata等[36]和Unni等[37]的研究證實。Chabon等[25]還觀察到另外3種KRAS突變的出現：G12A、Q61H和A146T，都是rociletinib可能的獲得性耐藥機制，其中只有KRAS G12A突變的1例患者僅存在這一種獲得性耐藥機制，另2例患者均表現多種耐藥機制共存：1例同時存在KRAS Q61H突變/PIK3CA E81K突變/MET D1304H點突變/MET擴增，1例同時存在KRAS A146T/KIT L576P突變。Eberlein等[38]進行的一項關于第三代EGFRTKI獲得性耐藥的RAS-MAPK通路的臨床前研究發現NRAS錯義突變NRAS E63K、NRAS拷貝數增加和KRAS拷貝數增加。Oxnard[30]的研究也涉及了RAS-MAPK通路，40例患者應用奧希替尼治療，其中1例患者T790M消失，并出現BRAF V600E突變。Kim等[34]在奧希替尼治療后患者中發現MAPK1基因擴增。Ercan等[39]的臨床前研究也得到了相似的結果，MAPK1擴增導致WZ4002耐藥。

針對RAS-MAPK通路激活導致的耐藥，Eberlein等[38]的臨床前研究發現NRAS突變和NRAS拷貝數增加的耐藥細胞對絲裂原活化的細胞外信號調節激酶（mitogen-activated extracellular signal-regulated kinase，MEK）抑制劑selumetinib聯合EGFR-TKI敏感。Ortiz-Cuaran等[24]的體外研究顯示，KRAS突變導致奧希替尼/rociletinib治療過程中細胞外調節蛋白激酶（extracellular regulated protein kinases，ERK）持續磷酸化，腫瘤細胞對藥物的敏感性下降，聯合應用奧希替尼和MEK抑制劑trametinib可以克服這種機制引起的耐藥，而單獨應用奧希替尼無法抑制MAPK下游信號通路的激活。Tricker等[40]同樣探索了這種聯合治療，發現WZ4002獲得性耐藥與ERK 1/2的快速再激活有關，第三代EGFR-TKI聯合trametinib可以阻止ERK 1/2的再激活，增加WZ4002引起的細胞凋亡，防止WZ4002敏感細胞出現耐藥。這些研究結果都支持了MEK抑制劑例如selumetinib和trametinib與新一代EGFR-TKI聯合，克服或者推遲EGFR-TKI獲得性耐藥的出現。一項奧希替尼聯合selumetinib的Ⅰ期臨床試驗正在進行中（NCT02143466），期待其最終結果。

2.6 FGF 2-FGFR 1信號通路激活

成纖維細胞生長因子受體（fibroblast growth factor receptor，FGFR）是一個多基因家族，屬于免疫球蛋白基因家族成員。FGFR1是一種跨膜蛋白質，屬于受體酪氨酸激酶，其細胞外段是成纖維細胞生長因子（fibroblast growth factor，FGF）配體的結合區。FGF也是一個多基因家族，FGF1和FGF2具有刺激成纖維細胞、血管內皮細胞、平滑肌細胞和神經細胞生長的生物學活性，FGFR1是它們的高親合性受體。當FGF與FGFR1胞外段結合后，受體細胞內段酪氨酸激酶活性區首先發生自身磷酸化，然后使受體靶蛋白發生反式磷酸化，通過蛋白質級聯反應將配體的信號傳遞給細胞核，表現為促進損傷修復、胚胎發育、骨骼形成、血管新生和神經再生等功效。這種信號傳遞是細胞正常生長所必需的，但當FGF自分泌過多時可引起多種疾病。

Kim等[34]在1例應用奧希替尼耐藥患者的研究中發現了FGF2-FGFR1通路導致的耐藥。奧希替尼耐藥腫瘤細胞出現FGFR1擴增，并且與基線相比表達了20倍高的FGF2mRNA。這一耐藥機制也在體外試驗中得到了證實，即FGF2分泌過多會引起EGFR敏感突變的NSCLC細胞對奧希替尼耐藥。

2.7 IGF 1 R異常激活

一項臨床前研究顯示，在兩個對WZ4002耐藥的細胞系中發現了異常激活的胰島素樣生長因子1受體（insulin-like growth factor 1 receptor，IGF1R），伴有胰島素樣生長因子結合蛋白3（insulin-like growth factor-binding protein 3，IGFBP3）的缺失[41]。下調IGF1R以及抑制IGF1R的激活可以使腫瘤細胞恢復對WZ4002的敏感性。這一結果提示，聯合應用IGF1R抑制劑和EGFR-TKI或許可以成為克服獲得性耐藥或者推遲、預防耐藥的有效手段。

3 細胞表型轉化

3.1 SCLC轉化

Piotrowska等[18]第一次報道了2例應用rociletinib后轉化為SCLC從而獲得性耐藥的患者。轉化的SCLC仍保持了原始的EGFR敏感突變，但是T790M消失。免疫組化結果顯示1例患者出現視網膜母細胞瘤（retinoblastoma，RB1）基因突變，而另1例患者未出現。Kim等[34]和Ham等[42]分別在對應用奧希替尼耐藥患者的研究中也發現了相同的機制。Ham等[42]報道了2例應用奧希替尼后因轉化為SCLC而耐藥的患者，PFS分別是14個月和18個月，組織病理結果均顯示為SCLC，CD56陽性，基因檢測EGFR敏感突變持續存在（1例L858R突變，1例19號外顯子缺失），但T790M消失。第1例患者還存在EGFR擴增，但不明確治療前是否存在。Kim等[34]發現1例患者奧希替尼治療后腫瘤細胞出現神經內分泌學形態，表達CD56、chromogranin A和synaptophysin，而這些并不存在于治療前。此例患者基因檢測還發現EGFR-T790M突變拷貝數下降，RB1缺失，與Piotrowska等[18]報道的患者類似。

3.2 上皮細胞-間質細胞轉化

Walter等[43]首次在體外試驗中證實上皮細胞-間質細胞轉化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）與第三代EGFR-TKI耐藥相關。研究培養含有L858R和T790M突變的細胞，并逐步增加rociletinib的劑量直至耐藥，發現EMT的基因增加，在耐藥克隆中出現vimentin、AXL、ZEB1、CDH5和FN1表達上調，E-cadherin、MIR200B、CLDN4、EPCAM和CLDN7表達下調及間葉細胞成分標志物。耐藥細胞克隆中EGFR表達也較原始細胞下調，沒有發現額外的EGFR突變。

4 其他

4.1 BIM缺失多態性

BIM是B細胞淋巴瘤-2（B-cell lymphoma 2，BCL-2）家族促凋亡成員之一。激活的BIM主要通過移位于線粒體膜，經不同途徑發揮促凋亡作用[44-45]。EGFR-TKI通過BIM上調引起帶有EGFR突變肺癌細胞的凋亡，其能編碼重要的促凋亡蛋白。東亞人群中BIM基因存在缺失多態性，導致這一人群缺乏促凋亡活性的BIM亞型，即促凋亡蛋白缺失，從而引起對EGFR-TKI的原發耐藥或削弱EGFRTKI的臨床療效[46-47]。一些研究已顯示，存在BIM缺失多態性的EGFR敏感突變患者，應用吉非替尼或厄洛替尼治療的PFS短于BIM野生型患者[48]。而BIM缺失多態性對第三代EGFR-TKI的影響還不確定。Tanimoto等[47]的臨床前研究發現，BIM缺失多態性的EGFR敏感突變NSCLC細胞也對奧希替尼耐藥。組蛋白去乙酰化酶（histone deacetylase，HDAC）抑制劑可以上調EGFR突變NSCLC細胞中BIM的表達，聯合應用奧希替尼和HDAC抑制劑伏立諾他（vorinostat）可以引起存在BIM缺失多態性和EGFR T790M突變NSCLC細胞的凋亡。

4.2 氧化供能途徑改變

腫瘤細胞的特點之一是代謝改變，以適應其需求增加的能量和化合物的數量，因此大多數腫瘤細胞表現出增強的糖酵解[49]。除了糖酵解，氧化磷酸化（oxidative phosphorylation，OxPhos）也能產生有效的三磷酸腺苷（adenosine-triphosphate，ATP）產物，對腫瘤細胞的生長代謝同樣至關重要[50]。Martin等[51]探索了這些代謝改變是否會導致奧希替尼耐藥。既往研究顯示，應用小分子抑制劑抑制腫瘤進程中起主要作用的激酶基因能減弱腫瘤細胞的糖酵解[52-53]。Martin等[51]進行的臨床前研究發現，奧希替尼能有效減少己糖激酶的活性（糖酵解的第一步酶促反應），減弱乳酸的產生（糖酵解的標志），降低硫氧還蛋白互作蛋白（糖酵解的負性調控蛋白）的表達，但在奧希替尼耐藥細胞中卻沒有發現這些改變。因此研究者認為，奧希替尼抑制腫瘤細胞的作用與其抑制糖酵解有關，其耐藥細胞的供能不依賴于糖酵解和EGFR通路。同時，研究發現，細胞可以通過調節能量源從葡萄糖到乳糖或半乳糖，使得細胞通過線粒體呼吸產生ATP，從而上調OxPhos，而這種通過半乳糖供能的細胞對奧希替尼不敏感。因此，當EGFR突變腫瘤細胞通過OxPhos而非糖酵解來獲取ATP時，細胞對奧希替尼敏感性下降。

針對這一機制，研究者考慮OxPhos抑制劑phenformin或許與奧希替尼有協同作用抑制腫瘤細胞的生長[51]。結果發現，OxPhos活性在EGFR突變未接受奧希替尼治療的細胞中維持高水平，奧希替尼治療后，糖酵解受到抑制的細胞高度依賴于OxPhos代謝來獲取能量，奧希替尼和phenformin聯合治療能阻止OxPhos所引起的代謝“逃逸”，有效阻止奧希替尼耐藥的出現。Martin等[51]還進行了動物體內實驗，證實了聯合應用奧希替尼和phenformin較單獨應用奧希替尼能推遲出現腫瘤復發的時間。另外，既往一些研究顯示，聯合應用MEK抑制劑能恢復奧希替尼的敏感性。而研究發現，在應用MEK抑制劑selumetinib一段時間后，奧希替尼耐藥能再次出現，而聯合應用奧希替尼/selumetinib/phenformin能抑制并且延遲這種耐藥的出現，主要是由于phenformin的OxPhos抑制作用[38,40]。總之，當EGFR突變腫瘤細胞通過OPhos而不是糖酵解來獲取ATP時，細胞對奧希替尼敏感性下降，而對OxPhos抑制劑敏感性增加。奧希替尼與OxPhos抑制劑聯合應用能推遲或阻止耐藥的出現。

5 小結

第三代EGFR-TKI在晚期NSCLC患者中的療效顯著，但不可避免出現的耐藥問題極大地限制了其臨床應用。關于其EGFR依賴和非EGFR依賴的耐藥機制逐漸被人們發現，因此，在腫瘤進展時再次進行組織活檢或收集血漿循環腫瘤DNA（circulating tumour DNA，ctDNA）明確耐藥機制顯得尤為重要，這是未來開發新一代EGFR-TKI和新的聯合治療的關鍵。