microRNA調控自噬在心肌缺血再灌注損傷中的研究進展

楊紅星,李紹旦 綜述 楊明會 審校

心肌缺血再灌注損傷(myocardial ischemia reperfusion injury，MIRI)是指在原發或繼發的缺血性心臟疾病中恢復心肌缺血部位的血液供應后卻加劇了缺血心肌的應激反應和細胞死亡的病理生理過程。導致MIRI的具體機制是復雜的，包括營養缺乏、再灌注活性氧應激、線粒體通透性轉換孔開放、再灌注導致的鈣紊亂、心肌細胞內pH值的快速變化[1]等，MIRI往往是它們多方面作用的結果。

自噬是高度進化保守的細胞內降解長壽命蛋白和受損細胞器的生理反應。自噬是細胞內依賴溶酶體的“自我消化”行為，能夠清除胞質內入侵病毒、大分子異常蛋白和衰老受損細胞器[2]，是細胞內固有的應激反應和防御機制。自噬與心血管或肌肉組織疾病、神經系統疾病、衰老和腫瘤等多種疾病有關。根據包裹物和運輸方式不同，可將自噬分為巨自噬(macroautophagy)、微自噬(microautophagy)、分子伴侶介導的自噬(chaperone-mediated autophagy,CMA)，以及新發現的DNA自噬[3]和RNA自噬[4]，通常所謂的自噬是指巨自噬。心肌細胞通過自噬途徑降解受損的線粒體等細胞器，維持細胞內能量平衡與環境穩定，從而抑制細胞凋亡發生。不少研究均已確定，自噬參與了MIRI的病理過程，并發揮著有益或有害的不同效應[5]。綜合性的研究[6]認為，再灌注期自噬的具體作用可能與缺血期缺血程度、缺血時間、自噬的激活程度、自噬與凋亡之間的交互作用、甚至所用模型和評價自噬的方法等有關。另外，自噬的具體作用還可能與誘發因素有關，營養缺乏、缺氧、感染、活性氧應激等不同的誘發因素，可導致自噬完全不同的作用。顯然自噬能夠相應地改變缺血再灌注損傷程度并對損傷心肌具有潛在的保護作用。因此深入研究自噬機制和調控通路十分重要。

1 MIRI中自噬的調控機制

1.1AMPK途徑5′單磷酸腺苷活化蛋白激酶(adenosine 5′-monophosphate-activated protein kinase，AMPK)即AMP依賴的蛋白激酶，是生物體能量代謝調節的關鍵分子。心肌缺血缺氧導致ATP水平下降，激活AMPK而誘導自噬。心肌缺血時以ATP為代表的能量水平下降， AMPK感知能量不足后被激活，誘發ULK1活化，啟動自噬起始環節[7]。例如PL菌絲體預處理部分地通過增加AMPK磷酸化水平上調自噬減少大鼠MIRI[8]。

1.2mTOR途徑雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)是心肌缺血階段調控自噬的核心蛋白，作為胞內能量感受體，它有兩種復合物形式：mTORC1和mTORC2，諸多調控方式通過抑制mTOR上調自噬緩解MIRI。例如，升高miRNA-221表達量能夠通過mTORC1/p-4EBP1途徑抑制自噬從而緩解缺氧/復氧導致的H9c2心肌細胞和新生大鼠心肌細胞損傷[9]。黃連素降低mTORC2磷酸化水平后進而抑制自噬顯著提高了H9c2心肌細胞存活率，減少了小鼠心肌梗死面積[10]。

1.3HIF-1參與的缺氧誘導自噬調控缺氧誘導因子1(hypoxia inducible factor 1，HIF-1)是一種核轉錄因子，能夠調節氧穩態，使細胞適應缺氧環境。HIF-1由HIF-1α和HIF-1β亞基組成，其中HIF-1α是缺氧期間的調節亞基。缺氧/復氧模型能顯著提高HIF-1的轉錄水平和蛋白表達水平。例如HIF-1α過表達或敲低可分別促進或抑制缺氧引起的自噬誘導，從而證實HIF-1介導的自噬能夠減輕缺氧誘導的H9c2細胞活力的降低[11]。

1.4活性氧和鈣活性氧自由基(reactive oxygen species,ROS)廣泛參與缺血再灌注后的損傷，是MIRI最重要的作用機制之一。再灌注期大量的ROS干擾線粒體膜極性與膜的完整性，增加線粒體通透性轉換孔開放，或對DNA造成損傷，導致大鼠心肌細胞凋亡或自噬性死亡增加[12]。鈣和鈣調蛋白在MIRI中也是誘導自噬的因素，MIRI中抑制Na+/Ga2+離子轉運蛋白就可以減少線粒體鈣超載從而降低過高的自噬水平[13]。再灌注期細胞膜Na+/Ga2+交換通道開放增加，使細胞內Ca2+濃度升高，通過mTOR依賴途徑進一步增強自噬。且肌漿網鈣泵抑制劑能顯著抑制細胞內Ca2+濃度從而抑制自噬，表明Ca2+濃度可影響再灌注期自噬水平[14]。

1.5NF-κB參與NF-κB是最初于B淋巴細胞中鑒定出的一種核轉錄因子，能夠被感染、ROS等多種刺激因素誘導入核，上調相關基因表達，調控炎癥反應、凋亡與自噬水平。在人臍靜脈內皮細胞中發現缺血再灌注損傷能夠促進依賴于p65-Beclin1的自噬水平升高，而抑制NF-κB可以降低 Beclin1參與的自噬流活化程度，增加細胞損傷[15]。

1.6內質網應激和未折疊蛋白反應MIRI過程中，ROS干擾胞內代謝平衡，擾亂了位于內質網內的蛋白折疊過程，激起內質網應激(endoplasmic reticulum stress,ERS)，未折疊蛋白反應(unfolded protein response,UPR)同樣參與其中。ERS和UPR能夠選擇性地減少蛋白質翻譯及合成、誘導自噬對已經錯誤折疊的蛋白質的清理，并能夠通過UPR三個信號傳感器IRE1、PERK和 ATF6將信號(例如通過真核啟動因子eIF2α)傳遞到細胞核或細胞質引發自噬[16]。

MIRI中自噬的調控機制與作用是多方面的，因此在MIRI中通過調控自噬處于恰當的水平顯示了對MIRI的良好治療前景。在MIRI和自噬機制中，microRNA近年來越來越引起人們的關注。microRNA是高度保守的長度為18～24個核苷酸的內源性單鏈非編碼RNA，被認為具有與靶mRNA的特異性結合位點結合后促進降解或抑制靶mRNA翻譯來行使轉錄后調控的作用。microRNA在細胞生長、增殖、分化、凋亡等方面具有重要的調控作用，而且，microRNA在心血管系統疾病過程包括MIRI中扮演了重要角色。因此，深入探索microRNA在MIRI中的作用與詳細機制具有十分重要的臨床意義。目前已報道多種microRNA通過調控自噬相關基因(autophagy related gene,ATG)或自噬調節因子干預自噬水平，在MIRI中扮演了重要角色。因此本文著重綜述microRNA通過調節自噬進而緩解MIRI的作用與機制。

2 microRNA調節自噬的不同環節

自噬的具體機制包括自噬的誘發、自噬泡開始形成、自噬泡延伸并識別包裹待降解的胞質成分、自噬泡與溶酶體融合、降解自噬泡內容物以供能量循環利用[17]。microRNA能夠通過不同途徑調控自噬的絕大部分過程。

2.1自噬的誘發階段哺乳動物細胞自噬的發生常見于能量危機或激素、生長因子、鈣離子、Bcl-2、ROS誘導時，始于mTOR或classIIIPI3K活化，導致ULK復合物(包括Atg1、Atg13、Atg17、Atg101)的激活。有研究[18]證實，miRNA-21在H9c2心肌細胞中激活Akt/mTOR通路,可能通過抑制ULK復合物下調缺氧/復氧模型的自噬流而減少細胞凋亡。miRNA-20a和miRNA-106b在C2C12成肌細胞中通過抑制ULK1的活化下調自噬[19]。另據報道miR-93能夠靶向調控ULK1并在缺氧條件下降低其蛋白表達水平從而抑制自噬[20]。

2.2自噬泡的形成與延伸初始自噬膜的形成需要PtdIns3K復合物的活化，它由PtdIns3K、Vps34、Vps15、Atg14和Atg6/Vps30(哺乳動物中的同系物Beclin1)組成。自噬泡的成核涉及包含PIK3C3/VPS34-PIK3R4/VPS15(磷酸肌醇-3-激酶)-BECN1-ATG14的磷脂酰肌醇3-激酶(PtdIns3K)復合物[21]。PtdIns3K復合物產生PtdIns3P(3磷酸-磷脂酰肌醇)，并募集多個自噬蛋白如Atg18、Atg20、Atg21和Atg24 (100,105,141)而成核，進而募集兩個泛素樣蛋白酶體Atg12-Atg5-Atg16和Atg8(在哺乳動物中的同系物就是LC3蛋白，是自噬活化的標記蛋白)-PE，促進自噬小體的膜伸長和擴大[22]。其中值得重點關注的是Atg8也就是LC3蛋白的羧基末端被蛋白酶Atg4B切割后形成胞質蛋白形式LC3-Ⅰ，LC3-Ⅰ進一步被磷脂酰乙醇胺脂化成為LC3-Ⅱ形式，后者可被募集到自噬泡膜上。通常由LC3-Ⅱ與LC3-I的比值可以評價自噬的活化程度。miRNA-30a、miRNA-376b[23]和miRNA-519a[24]抑制Beclin1從而抑制自噬泡初期的成核作用。miRNA-93能夠阻止LC3-I向LC3-Ⅱ的轉化,阻止它們被募集到自噬泡膜上從而起到抑制自噬體膜延展的作用[20]。有研究[25]顯示，一種被稱為ARC的抗自噬蛋白的靶標是Beclin1，而miR-325能夠通過抑制ARC進而抑制Beclin1下調自噬。Atg14是Ptdlns3(磷脂酰肌醇)激酶3復合物之一的特異性亞單位，能夠將Ptdlns3復合物靶向對標自噬體形成的可能位點，因此對自噬初始階段成核作用十分重要。有研究[26]認為抑制miRNA-130a能夠上調Atg14水平，激活自噬而緩解新生SD大鼠心肌細胞的缺氧/復氧損傷。miRNA-181a和miRNA-374a[24]通過抑制Atg5下調自噬。miRNA-375[27]通過負性調控Atg7抑制兩個泛素蛋白酶體系統介導的自噬泡的延伸。類似地，miRNA-630通過抑制Atg12，阻止泛素蛋白酶體系統形成Atg12-Atg5-Atg16復合物，抑制自噬膜的延展[24]。

2.3自噬體與溶酶體的融合自噬體成熟后，其雙層膜的外膜和溶酶體膜融合為一，內膜以及自噬體內容物一起被溶酶體酶降解——所得的單層膜囊泡被稱為自噬溶酶體。這種融合依賴于細胞內微管，由Rab7-SNARE、SKD1等蛋白以及溶酶體膜蛋白LAMP1/2參與。此外UVRAG可與PtdIns3K復合物結合,激活GTPaseRAB7后,促進自噬體與溶酶體的融合[22]。研究[28]顯示成熟自噬體膜上存在一種被稱為syntaxin 17的SNARE,通過與SNAP29和SNARE VAMP8相互作用促進了自噬溶酶體的形成。目前盡管沒有發現直接作用于自噬體和溶酶體融合階段的miRNA，但miRNA-98、miRNA-124、miRNA-130、miRNA-142、miRNA-204等可能通過抑制LAMP1/2和V-SNARE蛋白和囊泡相關膜蛋白7(VAMP7)，對自噬起負調控作用。例如，最新證實miRNA-33的直接靶標即包含溶酶體相關膜蛋白LAMP1并能降低其表達，從而顯示出抑制自噬的作用[29]。此外，UVRAG作為一種促自噬蛋白，能夠通過調控Vps復合體，使RAB7活性增強，促進自噬溶酶體的形成，miRNA-630和miRNA-374能夠調控UVRAG，則可推測該2個miRNA在促進自噬體與溶酶體的融合過程中扮演了重要角色[30]。

3 結語

近年來自噬研究呈明顯增加的趨勢，從自噬的誘發到自噬體與溶酶體融合過程中不斷有新的自噬基因被鑒別出來，自噬的調控因素也不斷被深入研究。microRNA作為轉錄后調控的重要形式，在各類細胞自噬中舉足輕重。雖然microRNA直接參與自噬體與溶酶體融合過程中的研究尚有不足，但是很多microRNA通過更廣泛的間接調控干預自噬。隨著人們對microRNA調控自噬機制研究的不斷深入，通過microRNA與自噬機制作為直接或間接藥物靶點或干預策略將越來越清晰地展現出其臨床應用前景。