葶藶生脈方對充血性心力衰竭大鼠心肌RhoA/ROCK信號通路的干預效應*

河北醫科大學第二醫院

田小超 郭秋紅△ 孫冠嬰△ 何偉亮 張 凱△(石家莊 050000)

實驗研究

葶藶生脈方對充血性心力衰竭大鼠心肌RhoA/ROCK信號通路的干預效應*

河北醫科大學第二醫院

田小超郭秋紅△孫冠嬰△何偉亮張凱△(石家莊050000)

目的：研究葶藶生脈方對充血性心力衰竭(CHF)大鼠左心室肌RhoA、ROCK1、p-MYPT-1及c-fos蛋白表達的影響，探討其防治心肌重塑的作用機制。方法：將健康雄性SD大鼠隨機分為5組，假手術組、模型組、葶藶生脈方低劑量組、高劑量組和對照組。除假手術組只分離腹主動脈不結扎外，其余4組采用腹主動脈縮窄法制作CHF大鼠模型。5組均于手術后4周開始灌胃、腹腔注射給藥(水)，連續8周。停藥(水)24 h后迅速股動脈取血及左心室組織剝離，采用放射免疫分析法檢測血漿AngⅡ含量，Western Blotting技術測定RhoA、ROCK1、p-MYPT-1及c-fos蛋白的表達。結果：與假手術組比較，模型組大鼠血漿AngⅡ含量，心肌組織RhoA、ROCK1、p-MYPT-1及c-fos蛋白表達均明顯增高(P<0.01)。與模型組比較，各給藥組大鼠心肌組織RhoA、ROCK1、p-MYPT-1及c-fos蛋白表達均顯著降低(P<0.01)，葶藶生脈方低劑量組、高劑量組大鼠血漿AngⅡ含量降低(P<0.01)。結論：葶藶生脈方通過調節RhoA/ROCK信號通路，降低RhoA、ROCK1、p-MYPT-1及c-fos蛋白表達，改善心肌重塑，從而有效緩解大鼠CHF。

充血性心力衰竭；葶藶生脈方；邢月朋；心氣虛；益氣溫陽；活血利水；RhoA/ROCK信號通路

充血性心力衰竭(CHF)是多種心臟疾病引起心肌結構和功能改變的最終轉歸，具有較高的發病率及死亡率。葶藶生脈方為全國名老中醫邢月朋根據多年臨床經驗總結出的治療氣虛血瘀、陽虛水停型CHF的經驗方，經過臨床驗證能有效緩解患者癥狀，改善生活質量，減少住院時間。在筆者以往的研究中發現，葶藶生脈方能改善壓力超負荷大鼠血流動力學各項指標，降低心肌細胞凋亡率，減輕心肌纖維化，有效防止心室重塑。[1-2]此研究擬通過觀察葶藶生脈方對RhoA/ROCK信號通路的干預效應，進一步探討其防治心室重塑的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 健康雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠60只，體質量170～200 g，購于河北醫科大學實驗動物中心。

1.2 藥品與試劑 葶藶生脈方由葶藶子、紅參、麥冬、五味子、桂枝、茯苓、川芎等藥物組成，實驗時分別配制成所需濃度的水煎液；鹽酸法舒地爾注射液購自天津紅日藥業股份有限公司；Ang II放免分析藥盒購自北京解放軍總醫院放免所； RhoA一抗、ROCK1一抗、p-MYPT-1一抗均購自英國Abcam公司，c-fos一抗購自美國Santa Cruz公司。

1.3 方法

1.3.1 CHF大鼠模型制備： 參考Anversea方法，[3]將60只大鼠用1%戊巴比妥鈉(40 mg/kg)行腹腔注射麻醉，于劍突下沿腹正中線逐層開腹，在雙腎動脈上方0.5 cm處分離腹主動脈，除假手術組10只大鼠只分離腹主動脈，不結扎外，其余50只沿腹主動脈平行放置一直徑0.7 mm 7號一次性注射器針頭，用0號手術絲線將腹主動脈和針頭結扎在一起，然后抽出針頭，使腹主動脈縮窄60%～70%。術后抗生素處理，觀察4周。

1.3.2 實驗動物分組及標本制備： 除假手術組外，將行腹主動脈縮窄術4周后存活大鼠40只隨機分為4組，每組10只：即模型組、葶藶生脈方高、低劑量組、對照組。假手術組、模型組給予蒸餾水灌胃，生理鹽水腹腔注射；葶藶生脈方組灌胃給藥(低劑量15 g/kg，高劑量30 g/kg)，生理鹽水腹腔注射；對照組腹腔注射法舒地爾10 mg/kg，蒸餾水灌胃。各組每次灌胃量按1 mL/100 g計算，腹腔注射量按5 mL/kg計算，每日1次，共給藥8周。末次給藥24 h后，用20%烏拉坦(6.5 mg/kg)腹腔注射麻醉。股動脈取血后迅速開胸摘取心臟，切取左心室用錫箔分裝，置于液氮速凍后，保存于-80℃冰箱中備用。

1.3.3 放射免疫分析法檢測血漿AngⅡ含量：將股動脈血置于肝素、EDTA抗凝試管中，4℃ 2 500 r/min分離血漿，采用放射免疫分析法，嚴格按試劑盒說明書檢測。

1.3.4 Western blotting 檢測RhoA、ROCK1、p-MYPT-1及c-fos蛋白表達：常規提取蛋白，考馬斯亮藍G-250染色法進行蛋白定量。經聚丙烯酰胺變性凝膠分離蛋白(上樣量為50 μg總蛋白)，電轉膜法將蛋白轉移到硝酸纖維素膜上，5%脫脂奶粉封閉，加入一抗抗體RhoA(1∶1 500)，ROCK1(1∶500)，p-MYPT-1(1∶500)，c-fos(1∶500)4℃過夜。去一抗，PBST沖洗4次，加入辣根過氧化酶標記的IgG二抗，室溫孵育2 h，洗膜，加入ECL試劑顯影定影。應用凝膠圖像處理系統進行目標條帶的灰度分析，以β-actin為內參，所得比值表示目標蛋白相對含量。

2 結果

2.1 各組大鼠血漿AngⅡ含量比較 與假手術組比較，模型組大鼠血漿AngⅡ含量顯著升高(P<0.01)；與模型組比較，葶藶生脈方高、低劑量組血漿AngⅡ含量顯著降低(P<0.01)，對照組含量降低，但差異無顯著性；葶藶生脈方高、低劑量組血漿AngⅡ含量低于對照組(P<0.05)。詳見表1。

表1 各組大鼠血漿AngⅡ含量比較

注：與假手術組比較，*P<0.01；與模型組比較，#P<0.01；與對照組比較，△P<0.05

2.2 各組大鼠左室心肌組織RhoA、ROCK1蛋白表達相對含量比較 與假手術組比較，模型組RhoA、ROCK1蛋白表達量升高(P<0.01)；與模型組比較，各給藥組RhoA、ROCK1蛋白表達量下降(P<0.01)；對照組ROCK1蛋白表達量低于葶藶生脈方高、低劑量組(P<0.05)。詳見表2。

組別nRhoAROCK1假手術組100.221±0.0470.098±0.021模型組100.612±0.093*0.401±0.069*低劑量組100.378±0.075#0.267±0.055#△高劑量組100.351±0.050#0.258±0.050#△對照組100.422±0.071#0.195±0.066#

注：與假手術組比較，*P<0.01；與模型組比較，#P<0.01；與對照組比較，△P<0.05

2.3 各組大鼠左室心肌組織p-MYPT-1、c-fos蛋白表達相對含量比較 與假手術組比較，模型組p-MYPT-1、c-fos蛋白表達量升高(P<0.01)；與模型組比較，各給藥組p-MYPT-1、c-fos蛋白表達量下降(P<0.01)。各給藥組之間比較，差異無顯著性(P>0.05)。詳見表3。

組別np-MYPT-1c-fos假手術組100.372±0.0670.332±0.050模型組100.821±0.101*0.720±0.089*低劑量組100.523±0.098#0.467±0.067#高劑量組100.497±0.071#0.442±0.053#對照組100.472±0.082#0.501±0.073#

注：與假手術組比較，*P<0.01；與模型組比較，#P<0.01

3 討論

心室重塑包括左室壁細胞結構成分和細胞外基質成分的改變，是導致心功能逐漸惡化的關鍵因素。眾多研究表明低分子量GTP酶RhoA以及其下游效應因子Rho激酶(ROCK1)通路介導的各種細胞功能參與了心肌重塑的發生發展各個階段。[4]刺激因子AngⅡ等通過與 Gq偶聯，增加RhoA的表達及向細胞膜的移位，表明RhoA蛋白是心臟腎素-血管緊張素系統( RAS)激活的下游靶點。[5]隨著CHF時RAS系統的激活，大鼠心肌RhoA表達逐漸增高, 伴隨發病時間延長, 心肌重塑增加, 心力衰竭加重，其增高就越明顯。因此RhoA 過度增加是促進CHF發生、發展的病理生理機制之一，RhoA/ROCK信號轉導通路將成為CHF的一個很有前景的新的治療干預靶點。研究證實，使用ROCK抑制劑可改善AngⅡ、壓力超負荷大鼠等所引起的心肌肥厚，[6]法舒地爾是目前臨床上唯一應用的ROCK抑制劑，通過特異性抑制ROCK能降低心肌纖維化和心肌細胞凋亡，從而改善心肌重構。[7]

眾多研究表明，原癌基因c-fos、c-jun、c-myc等參與了心肌重構過程中的心肌纖維化、左心室肥厚，c-fos 基因作為一個通用轉錄因子，與各種細胞外信號通過多條信號轉導途徑引起細胞應答導致心肌重構有關。有研究顯示心力衰竭大鼠心肌組織原癌基因c-fos表達增加，抑制ROCK能夠降低c-fos的表達，同時在心肌細胞激活RhoA可引起c-fos基因表達上調，[8]表明原癌基因c-fos參與RhoA/ROCK信號通路誘導心肌損傷。

全國名老中醫邢月朋根據多年臨床經驗，認為CHF的病機首推心氣虛，心氣虛為始發之根本，氣虛易及陽，導致陽氣虧虛，在此基礎上又繼發瘀血、水飲等病理產物。《慢性心力衰竭中西醫結合診療專家共識》亦指出虛、瘀、水是CHF的核心病機。[9]葶藶生脈方由紅參、黃芪、麥冬、五味子、葶藶子、桂枝、茯苓、白術、豬苓、澤瀉、丹參、紅花、川芎組成，具有益氣溫陽，活血利水之效。葶藶生脈方能抑制CHF大鼠RAS系統的過度激活，調控心肌組織CVF和TGF-β1的表達，減輕心肌纖維化，逆轉心室重塑，呈現出多途徑、多靶點的治療作用。[1-2]

本研究與以往結果相同，葶藶生脈方可有效降低壓力超負荷大鼠血漿AngⅡ含量。同時研究還表明葶藶生脈方和法舒地爾均可下調CHF大鼠心肌組織RhoA、ROCK1蛋白表達，在抑制ROCK1蛋白表達方面法舒地爾干預效應強于葶藶生脈方。Rho激酶對肌球蛋白輕鏈磷酸酯酶的調節主要是通過磷酸化MYPT-1來完成，兩藥均可降低RhoA/ROCK信號通道的重要下游通道MYPT-1磷酸化水平，以降低ROCK的活化程度。在本次實驗中，壓力超負荷大鼠心肌組織c-fos蛋白表達上調，用法舒地爾干預治療后，c-fos蛋白表達下降，表明法舒地爾抗心肌肥大與其抑制c-fos蛋白表達有關，葶藶生脈方亦能有效降低c-fos蛋白表達。綜上所述，葶藶生脈方對RhoA/ROCK信號通路的抑制可能是其逆轉心室重塑，防治CHF的作用機制之一。

[1] 翟卷平，郭秋紅，王卓，等. 葶藶生脈方對心衰大鼠心肌細胞凋亡的影響[J]. 河北中醫藥學報，2010，25(2)：5-6

[2] 郭秋紅，劉敬坡，趙淑明，等. 葶藶生脈方對心衰大鼠RAAS及心肌組織AT-1mRNA表達的影響[J]. 中華中醫藥雜志，2010，25(10)：1 654-1 656

[3] Anversea P，Hagopian M，Alder V. Quantitative radioautographic localization of protein synthesis in experimental cardiac hypertrophy[J]. Lab Invest，1973,29(3):282

[4] Kobayashi N，Takeshima H，Fukushima H，et al. Cardioprotective effects of pitavastatin on cardiac performance and remodeling in failing rathearts[J]. Am J Hypertens，2009，22 ( 2) : 176-182

[5] Morissette MR, Sah VP, Glembotski CC, et al. The Rho effector, PKN, regulates ANF gene transcription in cardiomyocytes through a serum response element[J]. Am J Physiol Heart Circ Physiol, 2000, 278(6):H 1 769-1 774

[6] Phrommintikul A, Tran L, Kompa A, et al. Effects of a rho kinase inhibitor on pressure overload induced cardiac hypertrophy and associated diastolic dysfunction[J]. Am J Physiol Heart Circ Physiol，2008, 294(4): 1 804-1 814

[7] Ueyama T, Sakoda T, Kawashima S, et al. Activated Rho A stimulates c-fos gene expression in myocardial cells[J].Circ Res,1997, 81: 672-678

[8] Shimokawa H, Rashid M. Development of Rho-kinase inhibitors for cardiovascular medicine[J]. Trends Pharmacol Sci, 2007, 28(6):296-302

[9] 李金根，徐浩. 慢性心力衰竭中西醫結合診療專家共識：亮點與解讀[J]. 中國中西醫結合雜志，2016，36(2)：142-145

InterventionEffectsofTingliShengmaiFangonSignalPathwayofMyocardialRhoA/ROCKinRatswithCongestiveHeartFailure

TIANXiao-chaoGUOQiu-hongSUNGuan-yingHEWei-liangZHANGKai(Shijiazhuang 050000)

Second Hospital of Hebei Medical University

Objective: to study the effect ofTingliShengmaiFangon left ventricular muscle RhoA, ROCK1, p-MYPT-1 and c-fos protein expression in rats with congestive heart failure (CHF), and to investigate its mechanism of prevention and treatment of myocardial remodeling. Methods: Healthy male SD rats were randomly divided into 5 groups: sham operation group, model group,TingliShengmaiFanglow dose group, high dose group and control group. Except for the dissection of abdominal aorta without ligature in the sham operation group, the abdominal aorta coarctation method was employed to make the CHF rat model of the other 4 groups. The 5 groups were treated with intragastric administration and intraperitoneal injection (water) for 8 weeks at the 4th week after the operation. After withdrawal (water) for 24 h, blood was collected and left ventricular tissue was rapidly removed from femoral artery. Plasma Ang II content was detected by radioimmunoassay. The expression of RhoA, ROCK1, p-MYPT-1 and c-fos protein was detected by Western Blotting. Results: Compared with sham operation group, the level of Ang II and the expression of RhoA, ROCK1, p-MYPT-1 and c-fos protein in myocardial tissue of model group increased significantly (P< 0.01). Compared with the model group, RhoA, ROCK1, p-MYPT-1 and c-fos protein expression of each administration group were significantly decreased (P< 0.01), plasma Ang II levels ofTingliShengmaiFanglow and high dose groups were reduced (P< 0.01). Conclusion:TingliShengmaiFangcan reduce the expression of p-MYPT-1 and c-fos protein and improve myocardial remodeling through regulating the pathway of RhoA/ROCK, RhoA, ROCK1, thus effectively alleviate the rat CHF.

congestive heart failure;TingliShengmaiFang;XINGYue-peng; heart-qi deficiency; ：YiqiWenyang(benefiting qi and warming yang);HuoxueLishui(activating blood and excreting water); RhoA/ROCK signaling pathway

R285.5

A

1007-5615(2017)06-0001-03

* 河北省中醫藥管理局資助項目：No.2016048

△ 河北中醫學院(石家莊050200)

張凱，男，碩士，副教授。

(2017-09-23 收稿)