不同劑量鱉甲煎丸對(duì)大鼠血小板聚集功能影響對(duì)照實(shí)驗(yàn)研究*

(邯鄲 056002)

河北工程大學(xué)附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科

不同劑量鱉甲煎丸對(duì)大鼠血小板聚集功能影響對(duì)照實(shí)驗(yàn)研究*

邢繼軍閆紀(jì)琳李彤中龐嵐△(邯鄲 056002)

河北工程大學(xué)附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科

目的：研究鱉甲煎丸對(duì)大鼠血小板聚集功能的影響。方法：將健康SD大鼠隨機(jī)分4組，空白對(duì)照組(生理鹽水)、阿司匹林組(陽(yáng)性對(duì)照組)、鱉甲煎丸高、低劑量組(2.0、 1.0 g/kg)。以二磷酸腺苷(ADP)、膠原、凝血酶為誘導(dǎo)劑活化血小板，采用比濁法觀察空白對(duì)照組及不同藥物處理組對(duì)血小板聚集率的影響。結(jié)果：空白對(duì)照組經(jīng)ADP、膠原、凝血酶為誘導(dǎo)劑活化后其血小板聚集率分別為(45.36±0.43)%、(47.14±0.43)%、(46.86±0.41)%，經(jīng)阿司匹林藥物處理后其血小板聚集率明顯下降分別為(28.84±0.21)%、(30.62±0.21)%、(29.85±0.21)%，低劑量鱉甲煎丸作用后血小板聚集率分別為(30.39±0.19)%、(32.08±0.15)%、(31.70±0.17)%，經(jīng)高劑量鱉甲煎丸作用后血小板聚集率(29.74±0.21)%、(31.52±0.21)%、(30.64±0.21)%，3組與空白對(duì)照組相比都能夠明顯降低血小板聚集率，差異有顯著性；以ADP和膠原為誘導(dǎo)劑活化的血小板中，阿司匹林組對(duì)血小板聚集抑制率[(36.24±0.01)%、(34.93±0.01)%]明顯高于低劑量[(32.79±0.01)%、(31.81±0.01)%]和高劑量鱉甲煎丸處理組[(34.22±0.01)%、(32.99±0.01)%]；在以凝血酶為誘導(dǎo)劑活化的血小板中，阿司匹林組對(duì)血小板聚集抑制率(36.19±0.01)%明顯高于低劑量鱉甲煎丸處理組(32.21±0.01)%，而與高劑量鱉甲煎丸處理組(34.49±0.01)% 差異無(wú)顯著性。結(jié)論：不同劑量鱉甲煎丸同阿司匹林一樣可有效抑制由ADP、膠原、凝血酶誘導(dǎo)的血小板聚集，應(yīng)用高劑量鱉甲煎丸能夠和阿司匹林有相同的血小板抑制效果及祛聚治療效果。

鱉甲煎丸；血小板聚集；二磷酸腺苷；凝血酶；膠原；對(duì)照實(shí)驗(yàn)

腦梗塞是好發(fā)于中老年人的常見(jiàn)病、多發(fā)病，具有高致殘率、高死亡率、高復(fù)發(fā)率的特點(diǎn)，血小板聚集在血栓形成過(guò)程中發(fā)揮重要作用，因此, 如何防治血小板聚集已成為目前研究腦血管病領(lǐng)域亟待解決的問(wèn)題之一。

鱉甲煎丸為醫(yī)圣張仲景所創(chuàng)，由鱉甲、牡丹皮、芍藥等藥物組成，具有活血化瘀、軟堅(jiān)散結(jié)的功效。現(xiàn)代藥理研究證實(shí)，芍藥中成分赤芍對(duì)二磷酸腺苷(ADP)誘導(dǎo)的血小板聚集具有明顯的抑制作用。[1]而牡丹皮有效組分丹皮酚、芍藥苷可有效抑制不同誘導(dǎo)劑活化后血小板的聚集。[2]但是尚未見(jiàn)到有關(guān)鱉甲煎丸對(duì)血小板聚集影響的實(shí)驗(yàn)研究報(bào)道。

本研究采用不同誘導(dǎo)劑活化大鼠血小板方法，觀察鱉甲煎丸對(duì)血小板聚集功能的影響，初步探討其抗血栓形成的作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：健康SD大鼠40只，體質(zhì)量(300±10) g，雌雄均有，由河北醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。

1.1.2 藥物：鱉甲煎丸由武漢中聯(lián)藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司提供。阿司匹林由拜耳醫(yī)藥保健有限公司提供。所有藥物用蒸餾水配成所需濃度，供灌胃給藥。

1.1.3 試劑： ADP、凝血酶、膠原購(gòu)自美國(guó)Biopool公司。

1.1.4 儀器：血小板聚集及血凝測(cè)試儀，北京世帝科學(xué)儀器儀器公司 MODEL PAPER-1型。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 分組及給藥： 取SD大鼠40只，隨機(jī)分為4組：空白對(duì)照組(生理鹽水)、阿司匹林組(30 mg/kg)(陽(yáng)性對(duì)照組)、鱉甲煎丸高劑量組(2.0 g/kg)、鱉甲煎丸低劑量組(1.0 g/kg)。實(shí)驗(yàn)開(kāi)始后，每組動(dòng)物均連續(xù)給藥5 h。

1.2.2 血小板血漿的制備: 末次給藥5 min后，用4%戊巴比妥鈉(40 mg/kg)腹腔注射麻醉，頸總動(dòng)脈插管取血，加入3.8%枸櫞酸鈉抗凝，以800 r/min離心10 min，取上層液即得富血小板血漿(PRP)，剩余血液以3 000 r/min離心10 min，取上層液即得貧血小板血漿(PPP)。

1.2.3 指標(biāo)測(cè)定: 用比濁法測(cè)定血小板聚集率，用PPP調(diào)定PRP使血小板計(jì)數(shù)為50×1010/ L，分別吸取PPP、PRP各300 μL加入測(cè)試杯中，以PPP調(diào)0，PRP調(diào)100%，PRP在37℃溫育5 min后,分別加入ADP、膠原、凝血酶激活血小板，測(cè)定5 min內(nèi)血小板最大聚集率。并按以下公式計(jì)算血小板聚集抑制百分率。血小板聚集抑制率=(對(duì)照管血小板聚集率-給藥管血小板聚集率/對(duì)照管血小板聚集率)×100%。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 不同實(shí)驗(yàn)組對(duì)經(jīng)ADP誘導(dǎo)激活后血小板聚集率的影響 經(jīng)ADP誘導(dǎo)激活后，空白對(duì)照組血小板聚集率為(45.36±0.43)%，陽(yáng)性對(duì)照組為(28.84±0.21)%，鱉甲煎丸低劑量組為(30.39±0.19)%，鱉甲煎丸高劑量組為(29.74±0.21)%，與空白對(duì)照組比較經(jīng)ADP誘導(dǎo)激活后阿司匹林及鱉甲煎丸不同劑量組血小板聚集率明顯下降(t阿司匹林=34.49P<0.05；t低劑量=33.02P<0.05；t高劑量=32.63P<0.05)；阿司匹林組在血小板聚集率及抑制率上與鱉甲煎丸不同劑量組比較有明顯優(yōu)勢(shì)。詳見(jiàn)表1。

項(xiàng)目空白組陽(yáng)性組低劑量組高劑量組血小板聚集率(%)45.36±0.4328.84±0.21▲30.39±0.19▲△29.74±0.21▲△抑制率(%)36.24±0.01*32.79±0.01△34.22±0.01△#

注：與空白組比較，▲P<0.05；與陽(yáng)性組比較，△P<0.05；與低劑量組比較，*P<0.05，#P>0.05

2.2 不同實(shí)驗(yàn)組對(duì)經(jīng)膠原誘導(dǎo)激活后血小板聚集率的影響 經(jīng)膠原誘導(dǎo)激活后，空白對(duì)照組血小板聚集率為(47.14±0.43)%，陽(yáng)性對(duì)照組為(30.62±0.21)%，鱉甲煎丸低劑量組為(32.08±0.15)%，鱉甲煎丸高劑量組為(31.52±0.21)%，與空白對(duì)照組比較經(jīng)膠原誘導(dǎo)激活后阿司匹林及鱉甲煎丸不同劑量組血小板聚集率明顯下降(t阿司匹林=34.49P<0.05；t低劑量=31.92P<0.05；t高劑量=32.63P<0.05)；阿司匹林組在血小板聚集率及抑制率上與鱉甲煎丸不同劑量組比較有明顯優(yōu)勢(shì)。詳見(jiàn)表2。

項(xiàng)目空白組陽(yáng)性組低劑量組高劑量組血小板聚集率(%)47.14±0.4330.62±0.21▲32.08±0.15▲△31.52±0.21▲△抑制率(%)34.93±0.01*31.81±0.01△ 32.99±0.01△#

注：與空白組比較，▲P<0.05； 與陽(yáng)性組比較， △P<0.05；與低劑量組比較，*P<0.05，#P>0.05

2.3 不同實(shí)驗(yàn)組對(duì)經(jīng)凝血酶誘導(dǎo)激活后血小板聚集率的影響 經(jīng)凝血酶誘導(dǎo)激活后，空白對(duì)照組血小板聚集率為(46.86±0.41)%，陽(yáng)性對(duì)照組為(29.85±0.21)%，鱉甲煎丸低劑量組為(31.70±0.17)%，鱉甲煎丸高劑量組為(30.64±0.21)%，與空白對(duì)照組比較經(jīng)凝血酶誘導(dǎo)激活后阿司匹林及鱉甲煎丸不同劑量組血小板聚集率明顯下降(t阿司匹林=37.52P<0.05；t低劑量=34.74P<0.05；t高劑量=35.52P<0.05)；阿司匹林組在血小板聚集率上與鱉甲煎丸不同劑量組比較有明顯優(yōu)勢(shì)在對(duì)血小板抑制率上高于鱉甲煎丸低劑量組(t=4.37P<0.05)，而與鱉甲煎丸高劑量組比較差異無(wú)顯著性(t=1.91，P=0.06)。對(duì)于經(jīng)凝血酶誘導(dǎo)激活的血小板，高劑量鱉甲煎丸與阿司匹林有著相同的抑制血小板聚集的效果。詳見(jiàn)表3。

項(xiàng)目空白組陽(yáng)性組低劑量組高劑量組血小板聚集率(%)46.86±0.4129.85±0.21▲31.70±0.17▲△30.64±0.21▲△*抑制率(%)36.19±0.01*32.21±0.01△34.49±0.01△*○

注：與空白組比較，▲P<0.05；與陽(yáng)性組比較，△P<0.05， ○P>0.05；與低劑量組比較，*P<0.05

3 討論

血小板具有黏附聚集和釋放功能, 并且具有較強(qiáng)的促凝活性, 在血栓形成與止血過(guò)程中起著重要作用。血小板過(guò)度活化以及凝血系統(tǒng)的激活則易導(dǎo)致血栓形成，反之則有出血的危險(xiǎn)。因此血小板和凝血異常是各種出血性和血栓性疾病的病理生理基礎(chǔ)。[3]一般情況下血小板處于靜息狀態(tài)，當(dāng)血管內(nèi)皮損傷或血液在某些病理生理刺激因子作用下，血小板發(fā)生黏附、聚集和釋放等活化反應(yīng)。血小板聚集是指凝血的一個(gè)過(guò)程，即血小板之間互相黏附形成的一個(gè)個(gè)血小板團(tuán)，是指許多血小板黏附在一起的一個(gè)狀態(tài)。血小板的聚集功能是能夠?qū)ρ“骞δ?、血液凝血狀態(tài)做出反映的重要指標(biāo)，具有良好的臨床應(yīng)用價(jià)值。[4]現(xiàn)代醫(yī)學(xué)表明血小板聚集功能異常與缺血性腦卒中的發(fā)生極為密切，并能預(yù)警急性缺血性腦卒中的發(fā)生。[5]近年研究也發(fā)現(xiàn)心腦血管缺血性疾病患者，體循環(huán)中血小板聚集活性顯著增高，[6]因此降低血小板的聚集率, 抑制血小板活化將有助于預(yù)防血栓的形成, 改善血液的凝聚狀態(tài), 對(duì)腦血管疾病的防治起重要作用。

阿司匹林是研究最廣泛的抗血小板藥物，其作用機(jī)制為通過(guò)抑制血小板花生四烯酸代謝來(lái)抑制血小板黏附和聚集。缺血性卒中早期使用阿司匹林，可降低卒中復(fù)發(fā)的危險(xiǎn)性并改善功能轉(zhuǎn)歸，[7-8]已取得較高級(jí)別的循環(huán)醫(yī)學(xué)證據(jù)。而鱉甲煎丸為《金匱要略·瘧癥》篇治療瘧母之主方, 是張仲景制方藥物最多的方劑，臨床應(yīng)用已二千 余年，組方嚴(yán)密，配伍科學(xué)，具有活血化瘀、 軟堅(jiān)散結(jié)的作用。其藥物組成分析發(fā)現(xiàn)，其中牡丹皮、芍藥組份通過(guò)不同程度地抑制體外經(jīng)不同誘導(dǎo)劑活化后的血小板聚集反應(yīng)，從而發(fā)揮降低血小板聚集率的作用。[7]因此，筆者在實(shí)驗(yàn)時(shí)選取了臨床上療效較好且得到公認(rèn)的藥物阿司匹林作為陽(yáng)性對(duì)照藥物，以觀察鱉甲煎丸對(duì)血小板的聚集作用影響，為臨床應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)和依據(jù)。

本研究結(jié)果顯示，不同劑量鱉甲煎丸同阿司匹林一樣能夠有效抑制由ADP、凝血酶、膠原等不同誘導(dǎo)劑活化后的血小板聚集，經(jīng)不同劑量鱉甲煎丸處理后的血小板聚集率雖高于阿司匹林組，但較空白對(duì)照組明顯下降。鱉甲煎丸組份中含有牡丹皮、芍藥，兩者在對(duì)影響血小板的聚集發(fā)揮了重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，赤芍總苷能顯著延長(zhǎng)小鼠和大鼠的凝血時(shí)間，具有顯著的抗凝、抗血栓形成作用。[9]因此通過(guò)使用鱉甲煎丸，可以發(fā)揮降低血栓形成和血栓類(lèi)疾病風(fēng)險(xiǎn)的作用，對(duì)預(yù)防缺血性腦血管疾病的發(fā)生起著重要的輔助治療作用，為臨床研制開(kāi)發(fā)新的防治心腦血管疾病的藥物奠定理論基礎(chǔ)。通過(guò)不同劑量分組結(jié)果，對(duì)于凝血酶導(dǎo)致的血小板聚集，高劑量鱉甲煎丸組與阿司匹林組的抑制率無(wú)明顯差異，其血小板聚集率高于阿司匹林組，因此，在臨床治療中使用高劑量鱉甲煎丸是安全的，可以起到較好的治療效果，同時(shí)又能避免臨床出現(xiàn)用藥過(guò)量導(dǎo)致的凝血機(jī)制障礙等副反應(yīng)，從而發(fā)揮較好的祛聚作用。

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R285.5

A

1007-5615(2017)06-0039-03

* 河北省邯鄲市科技局資助項(xiàng)目：No.1123108078-11

Δ 邯鄲市婦幼醫(yī)院(邯鄲056002)

(2017-10-16 收稿)