雜交鱘中草藥免疫增強劑的體外快速篩選

唐黎 龔蘆璽 姜海波 林艷紅

摘要：采用雜交鱘的離體外周血和中草藥的水提液進行共同孵育的方法，快速篩選雜交鱘中草藥免疫增強劑。實驗選用質量為365 g，體長18 cm的雜交鱘魚1尾，抽取雜交鱘魚的血樣，提取其白細胞，用苦參、茵陳、杜仲、淫羊藿、茯苓、紫草、甘草、生地等八種中草藥濃度為0.5 g/mL的水提液與雜交鱘的外周血白細胞共同孵育后，分別采用抗超氧陰離子試劑盒、金黃色葡萄球菌法來測定雜交鱘的氧呼吸爆發活性以及中草藥對雜交鱘白細胞的吞噬活性（吞噬活性以吞噬百分比（phagocytic percent-age，PP）和吞噬指數（phagocytic index，PI）表示）的影響。結果表明：各處理組外周血白細胞氧呼吸爆發活性均存在顯著差異（P<005），其中苦參、茵陳、杜仲、淫羊藿、茯苓、紫草和甘草組顯著高于對照組（P<0.05），生地顯著低于對照組（P<0.05）。苦參、茯苓、生地組外周血白細胞吞噬百分比顯著高于對照組（P<0.05）。苦參、生地組外周血白細胞吞噬指數顯著高于對照組（P<0.05），紫草和甘草組外周血白細胞吞噬指數顯著低于對照組（P<0.05）。結論：結合上述評價指標，苦參、茯苓更加適合作為雜交鱘候選免疫增強劑。

關鍵詞：中草藥；雜交鱘；免疫力

雜交鱘已成為我國新興的淡水養殖優良品種，它具有養殖經濟效益好、飼料轉化率高、生長快等特點，由于集約化程度越來越高，養殖密度不斷增加也給鱘魚的養殖帶來病害方面的問題。溶菌酶是魚類抵擋病原菌感染的重要酶類[1]，因此，許多學者對魚類溶菌酶的特性和血液白細胞的吞噬活性都進行了研究[2-3]。中草藥具有毒副作用小、價格低廉、資源豐富等優點，并且它能夠明顯促進機體的非特異性及特異性免疫反應，提高機體的抵抗力和抗病力，是廣泛應用在動物體的免疫增強劑[4]。使用中草藥作為免疫增強劑不僅可以解決抗生素、化學藥物等引發的養殖魚類藥殘超標和抗 （耐） 藥性等問題，而且還符合漁業發展中無公害水產品生產上綠色化的需求[5]，現已研究發現多種中草藥有效成分可以增強動物機體的免疫功能，主要是通過調動非特異性來抵抗病原生物實現的[6]。采用免疫增強劑增強魚體的抵抗力和免疫力，降低魚病的發生率，在當下正逐漸成為保證養殖效益和控制魚病的關鍵措施。通過將免疫增強劑添加在魚類的飼料中現已成為了國內外學者研究的熱點[7-12]。

關于鱘魚養殖的研究多局限于對鱘生長指標及存活率等方面的評價， 但是對鱘魚生理指標變化的探討較少。本實驗以雜交鱘為研究對象，采用雜交鱘外周血與中草藥的水提液共同孵育的方法，探討了中草藥對雜交鱘氧呼吸爆發活性和吞噬活性的影響，旨在篩選出能提高雜交鱘免疫力和抗病能力的免疫增強劑。

1實驗材料與方法

1.1實驗用中草藥和實驗用魚

實驗所用8種中草藥購于貴州省貴陽花溪區中草藥藥店，中草藥的中文名及拉丁文名如表1所示。實驗用雜交鱘魚購于貴州省貴陽市花溪區貴州大學南校區附近農貿市場，質量365 g，體長18 cm，無病無傷，暫養于水產養殖實驗室。

1.2主要試劑及配制方法

1.2.1Giemsa染色液5 g吉姆薩粉加入22 mL丙三醇，研磨至無顆粒狀態，56 ℃下保溫2 h之后，加入33 mL甲酸，得到吉姆薩母液，棕色試劑瓶中備用。用時將吉姆薩與PBS液按照1∶9比例混勻（現配現用）。

表1中草藥中文名及拉丁文名

中草藥學名苦參Sophora flavescens Ait茵陳Artemisiae Scopariae Herba杜仲Eucommia ulmoides Olive淫羊藿E.brevicornum Maxim茯苓Poria cocos（ Schw.） Wolf紫草Arnebia euchroma（Royle） Johnst甘草Radix ghycyrrhizae生地Rehmannia glutinosa Libosch1.2.20.2%臺盼藍0.2 g臺盼藍溶于100 mL超純水中，磁力攪拌過夜，用特曼紙過濾之后4 ℃保存，使用前加4倍生理鹽水稀釋。

1.2.390%細胞分離儲存液90 mL細胞分離液加入10 mL 1.5 M NaCl。

1.2.4肝素用PBS稀釋成3 000 U/mL，045 μm無菌過濾膜過濾，在4 ℃下保存。

1.2.5PBS分別按順序稀釋Na2HPO4 1.07 g，KH2PO4 0.39 g，NaCl 8.5 g，用HCl調節pH至7.2～7.4，用1 000 mL容量瓶進行定容，高壓滅菌，在4 ℃下保存。

1.3實驗方法

1.3.1中草藥水提液樣品制備的處理將8種中草藥用天平稱取各10 g，置于烘箱中50 ℃烘烤 24 h，用中草藥粉碎機粉碎，接著過目篩，裝入自封袋中（保證藥物不能漏出自封袋），置于室溫干燥保存。將制得的中藥分別加入500 mL燒杯中，加入300 mL蒸餾水，浸泡30 min，開大火煎煮30 min之后，另外加入200 mL蒸餾水，小火煎煮60 min，倒出藥液，加入100 mL蒸餾水對藥渣繼續煎煮30 min，倒出藥液混合第一次倒出的藥液。濃縮至20 mL，保證原藥為0.5 g/mL。將濃縮之后的藥液進行離心處理，轉速為8 500 r/min，離心30 min，取上層清液，過0.45 μm無菌過濾膜，制成0.5 g/mL的中草藥提取液樣品。

1.3.2雜交鱘血液樣品的的制備取雜交鱘魚1條，用丁香酚（1 L水體中加入0.05 mL的丁香酚）進行麻醉處理， 用含有0.3 mL肝素（濃度：1 500 U肝素溶于1 mL PBS中）的10 mL—次性注射器取血。將所有血液混合，加入等體積的細胞培養基（L-15）。另取10 mL離心管，加入1.5 mL密度梯度分離液，沿管壁緩慢加入3 mL稀釋后的血液，室溫800 g離心20 min；取中間白細胞層于新離心管，加1 mL L-15IV輕輕混合均勻；取20 μL細胞，加入等體積的0.2%臺盼藍（W/V，使用前與4.25%NaCl按4∶1混合），顯微鏡下數數得到細胞懸液初始濃度；用 L-15IV將其稀釋成2×107 cell/mL作氧負離子檢測、5×106 cell/mL作吞噬活性檢測。

1.3.3金黃色葡萄球菌懸液的制備金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）的凍干粉購于北納創聯生物技術有限公司，其培養基的各組分如表2所示。

表2金黃色葡萄球菌的培養基成分

培養基成分名稱 含量 牛肉膏3～5 g 蛋白胨10 g NaCl5 g 瓊脂20%～25%培養基按照上述成分制備，高壓滅菌之后，倒平板，冷卻至室溫。

（1） 操作準備：凍干管的頂部為熔封處，管身貼有標簽，底部為凍干菌粉。打管前應于4 ℃保存，使用時去除標簽，用75%酒精擦拭管壁，移入安全柜操作。

（2） 打管：用75%酒精擦拭，將凍干管頂部置于火焰灼燒。后迅速滴加無菌水使得管壁破損，用鑷子輕輕敲去碎玻璃即可。

（3） 將0.3 mL左右無菌水或培養基注入凍干管中，吹打，充分溶解成菌懸液。吸取菌懸液，打入1～2個試管或平板，或50 mL液體培養基中，在菌種說明書中規定條件下培養。

（4） 培養成功后根據需要直接使用或接種10%接種量液體培養。

（5） LB培養基配制：950 mL去離子H2O加蛋白胨10 kg、酵母提取物5 g、NaCL 10 g定容至1 000 mL，再加瓊脂15 g/L，最后高溫高壓滅菌。

（6） 將金黃色葡萄球菌接種于淡水魚類瓊脂培養基（FWA）斜面上，28 ℃下培養24～48 h。

（7） 用無菌生理鹽水（0.65%，W/W）洗下菌落，并稀釋成一定濃度。

（8） 加入終濃度為1%的福爾馬林，28 ℃滅活24 h，用無菌生理鹽水清洗3次，調整細菌濃度到1×108個/mL，保存于4 ℃冰箱中備用。

1.3.4氧呼吸爆發活性檢測氧呼吸爆發活性使用試劑盒進行測定，操作過程見表3。

計算公式為：

抗超氧陰離子活力單位（U/L）=對照OD值-測定OD值對照OD值-標準OD值×標準品濃度（0.15 mg/mL）×1 000 mL×樣品測試前稀釋倍數

數據的處理和分析，采用Excel和OriginPro5.0軟件對獲得的實驗數據進行處理及分析。

1.3.4白細胞吞噬活性的檢測

根據孫曉飛等[17]等的實驗方法進行本次實驗操作，操作步驟如下：

從鱘魚鰓動脈采血1 mL，置于含0.5 mL肝素溶液（2%，W/V）的試管中混勻，加入約0.5 mL的金黃色葡萄球菌懸液，充分混勻后于25 ℃下水浴60 min。水浴期間每隔10 min搖勻1次。取上述混合液涂片，每個血樣涂2片。晾干后滴加甲醇固定5～7 min，蒸餾水沖洗，Giemsa染色1～1.5 h，自來水沖洗后再用蒸餾水沖洗，晾干。試驗重復2次。吞噬活性以吞噬百分比（PP）和吞噬指數（PI）表示，分別計算吞噬百分比和吞噬指數，計算公式如下：

吞噬百分比（PP）=100個吞噬細胞中參與吞噬的細胞數/100×100%

吞噬指數（PI）=吞噬細胞內的細菌總數/參與吞噬的吞噬細胞數

2結果

2.1中草藥對雜交鱘魚氧呼吸爆發活性的影響

通過采用雜交鱘的離體外周血和中草藥的水提液進行共同孵育后，運用抗超氧陰離子試劑盒測定其抗超氧陰離子，根據分光度的值可判斷中草藥對雜交鱘外周血白細胞氧呼吸爆發活性的影響。根據“檢測抗超氧陰離子自由基或產生超氧陰離子自由基試劑盒”的檢測原理吸光度大的產生抗超氧陰離子，抗超氧陰離子單位的值就越小。由圖1可知，本次實驗所采用的苦參、茵陳、杜仲、淫羊藿、茯苓、紫草、甘草。生地等八種中草藥中，只有生地的抗超氧陰離子單位的OD值比未添加中草藥的對照組低；其余七種中草藥均比未添加中草藥的對照組高。數據統計結果如圖1所示。

2.2中草藥對雜交鱘魚吞噬活性的影響

通過采用白細胞對金黃色葡萄球菌具有吞噬能力的原理，進行涂片、Giemsa染色等手段測定中草藥與雜交鱘外周血共同孵育后，外周血白細胞的吞噬活性。吞噬活性以吞噬百分比和吞噬指數共同決定，由圖2可知，所采用的8種中草藥與雜交鱘外周血共同孵育后所測的吞噬百分比只有茵陳、杜仲高于未添加中草藥的對照組，其他均低于對照組；而吞噬指數中，只有添加苦參、杜仲、茯苓、生地四種中草藥的組別高于未添加中草藥的對照組，其余四種中草藥添加的組別均低于未添加中草藥的對照組。吞噬百分比和吞噬指數的數據處理結果分別如圖2、圖3所示。

3分析與討論

關于用中草藥代替激素，合成藥物作為動物的免疫增強劑，促進動物的生長和抗病的作用，國內外已有學者進行了研究，并得到了可實施性的研究結果。張耀武[3]在復方中草藥制劑濃度分別為0.5%、1.0%、2.0%礎飼料的中，持續投喂了60 d過后，根據測定實驗的黃顙魚的血清溶酶活性、生長性能、血細胞的吞噬活性等指標，比較中草藥制劑對黃顙魚非特異性免疫功能的影響。結果表明，濃度為0.5%的復方中草藥制劑對黃顙魚的生長影響顯著；濃度為1.0%、2.0%的復方中草藥制劑對黃顙魚的溶酶菌活力和吞噬活性影響極顯著，對于血清溶酶活性、生長性能、血細胞的吞噬活性實驗組能顯著提高。張照紅[11]用三個不同劑量的黃芪等七味復方中草藥奧尼羅非魚進行投喂，結果表明，投喂到45 d，60 d時，1.0%、1.5%的復方中草藥添加組可以顯著地提高奧尼羅非魚的絕對增重量；1.0%、1.5%的添加組隊奧尼羅非魚的脾臟指數程度最大；投喂到30 d時，1.0%、1.5%的添加組對血液中白細胞的吞噬百分率（PP）得到了顯著或者極顯著的提高；到45 d時，血液中白細胞吞噬指數（PI）得到了顯著提高；李華[8]等將牛膝、板藍根、甘草、陳皮、肉桂、麥芽、神曲 7 味中草藥按一定的比例混勻，以2%、4%、6%的質量分數添加到基礎飼料中連續投喂大菱鲆，結果表明，4%的濃度組對大菱鲆的血清溶酶菌活力和抗菌活力有顯著升高（ P<0.05），4%的濃度組對魚血清補體C3含量有顯著升高（ P<0.05）。攻毒試驗表明，4%濃度組的存活率最大，對提高大菱鲆的非特異性免疫力和抗病力效果最為顯著的是4%濃度組。盛竹梅[1]等用麻黃、苦參、黃芩、五倍子、紫蘇、石榴皮6余味中草藥制成復方制劑，按照0.5%、20%、4.0%的比例對鯽魚進行注射式給藥，結果表明，濃度越大血清殺菌活性越高，4.0%濃度組的NBT陽性細胞數差異顯著，鯽魚的非特異性免疫功能能被該復方中草藥制劑有效地提高。孫曉飛，郭偉良，謝珍玉等[17]用39中草藥對石斑魚采用離體外周血白細胞與中草藥提液共同孵育法，對棕點石斑魚進行免疫增增強劑的快速篩選。結果表明，39種中草藥中有10種對棕點石斑魚白細胞氧呼吸爆發性顯著提高15%，有3種草藥可以同時提高棕點石斑魚的氧呼吸爆發活性和吞噬活性，分別為墨旱蓮、雞血藤、黃柏。