Clusterin、Caspase-3在胃癌中的表達及其相關性研究①

李 衛，侯 杰，焦成斌

(佳木斯大學附屬第一醫院，黑龍江 佳木斯 154003)

Clusterin、Caspase-3在胃癌中的表達及其相關性研究①

李 衛，侯 杰，焦成斌

(佳木斯大學附屬第一醫院，黑龍江 佳木斯 154003)

目的：通過檢測胃癌組織、正常胃黏膜組織中Clusterin及Caspase-3的表達情況，探討二者與胃癌發生、發展的關系及二者的相關性。方法：運用蛋白質印跡法和免疫組化SP法檢測這兩個蛋白在胃癌組織和正常胃黏膜組織中的表達情況。結果：免疫組化SP法結果顯示，在胃癌組織及正常胃黏膜組織中，Clusterin的表達陽性率分別為78.0%、26.0%，Clusterin在胃癌中高表達，并顯著高正常胃黏膜的表達(P<0.05)；Caspase-3的表達陽性率分別為24.0%、78.0%，Caspase-3在胃癌組織中低表達，顯著低于正常胃黏膜組織，差異有統計學意義(P<0.05)；Caspase-3和Clusterin的蛋白表達與胃癌的組織學分型、TNM分型、淋巴結轉移以及胃癌浸潤深度有緊密的聯系(P<0.05)。Spearman等級相關分析發現在胃癌組織中Clusterin和Caspase-3的表達呈負相關(P<0.05)。結論：Clusterin和Caspase-3與胃癌的發生、發展關系密切，可能是胃癌診斷及治療研究的新方向。

Clusterin；Caspase-3；胃癌；免疫組化；蛋白質印跡法

胃癌是我國最常見的惡性腫瘤之一，每年約有70萬人死于胃癌[1]。有多種因素、基因參與到胃癌的發生及發展過程中，共同調控胃癌的發展。有研究發現凋亡抑制因子在胃癌的發生和發展過程中扮演著重要的角色。Clusterin是不久前發現的一種重要的調控細胞凋亡的凋亡抑制因子，有報道高表達的Clusterin能抑制腫瘤細胞的凋亡，通過調控細胞周期蛋白以及有絲分裂誘導腫瘤細胞的異常增殖[2]。有大量研究報道Caspase-3可調控多種惡性腫瘤細胞的增長，Caspase-3的活化會抑制腫瘤細胞的增殖，誘導其凋亡[3]。本文通過檢測胃癌組織與正常胃黏膜組織中Clusterin和Caspase-3的蛋白表達，探究Clusterin蛋白對胃癌的發生、發展的調控作用以及Clusterin表達與凋亡相關因子Caspase-3之間的相關關系。

1 資料和方法

1.1 研究對象

收集2014-12～2015-12在我院就診的胃癌患者的胃癌組織50例作為觀察組，取同一患者距腫瘤邊緣10cm以上正常胃黏膜組織50例作為對照組。其中男36例，女14例，年齡21～83歲，平均(56.3±6.1)歲。受試者以及研究是獲得醫院倫理委員會同意并符合規定；所有試驗均得到受試者知曉并簽署知情同意書。試驗用的人體標本在采集后1h內迅速放入液氮罐中速凍，于-80℃冰箱中保存，另取受試者的腫瘤組織及癌旁組織用于制備石蠟標本，待檢。所有病例均按照世界衛生組織和研究會制定的胃癌分類標準進行分類：其中共有35例乳頭狀腺癌和高中分化腺癌等分化型，15例低分化、未分化腺癌、印戒細胞癌和黏液癌等未分化型。依據1997年國際抗癌聯盟(UICC)制定的TNM分期標準進行臨床分期；TNM分期，其中5例為Ⅰ期，8例Ⅱ期，21例為Ⅲ期，16例為Ⅳ期。所有受試者在手術前都沒有經過放化療，均住院進行胃癌根治術，術后所有患者以及腫瘤組織都經過病理證實。

1.2 儀器

萊卡倒置熒光顯微鏡(型號DM1L)購自德國萊卡公司；微量離心機(型號KA-1000)購自上海市安亭科學儀器廠；冷凍離心機(型號CS-15R)購自Beckman公司，電子天平(型號BT323S)購自德國賽多利斯有限公司；電泳槽(型號525BR027843)購自美國Bio-Rad公司；半自動生化儀購自東北沃特爾科技有限公司。

1.3 主要試劑

Clusterin 和Caspase-3抗體購自NEO MAEKERS公司。免疫組化試劑盒購于北京中山生物技術有限公司。

1.4 實驗方法

免疫組化染色采用SP法。用1：100稀釋并配置Clusterin和Caspase-3抗體待用，運用DAB 試劑來顯色，用蘇木素按照說明書步驟對組織進行復染，設立陰性對照組，采用PBS作為一抗對照，若細胞質或者胞核中為棕黃色則是陽性細胞。

Western blot檢測 配置1.5mol/L Tris-HCl(pH 8.8)、0.5 mol/L Tris-HCl(pH6.8)30%丙烯酰胺溶液、10%過硫酸胺的配制等溶液。從-80℃冰箱中取出待檢的組織，稱重80～100mg的組織，用PBS沖洗，按照Western blot的實驗步驟：將組織研勻，靜置冰上30min后，在4℃、12000 RPM下離心15min，吸取上清，即為蛋白溶液。另取少量蛋白溶液以BCA法進行蛋白含量測定，配置電泳膠，上樣，電泳，轉膜，用脫脂奶粉封閉液進行封閉，一抗孵育，結合二抗，化學發光、顯影和定影，檢測組織中Clusterin和Caspase-3的表達情況。

1.5 評價標準

采用萊卡倒置熒光顯微鏡觀察切片，每張切片隨機選取5個高倍視野，按染色強度、陽性細胞數占腫瘤細胞總數的百分比綜合計分。Clusterin以細胞膜染棕黃色為陽性，Caspase-3以細胞核染棕黃色為陽性。具體如下，顯色細胞數(染色陽性百分比)：﹤5%為0分；6%～20%為1分；21%～50%為2分；>50%為3分，實驗數據統一采用總積分>1，即統計分析的標準為陽性表達。

1.6 統計學方法

采用SPSS16.0軟件行數據分析，GraphPad Prism 5軟件進行作圖，計數資料采用卡方檢驗,兩變量之間采用 Spearman行等級相關分析。檢驗水準為α= 0. 05。以P<0.05為有顯著性差異。

2 結果

2.1 正常胃黏膜組織及胃癌組織中 Clusterin和Caspase-3的蛋白表達

Western blot結果顯示在胃癌組織區的Clusterin蛋白呈高表達，Caspase-3呈低表達，而正常胃黏膜組織的Clusterin蛋白表達降低，Caspase-3 呈現一個高表達狀態。免疫組化檢測結果顯示，在胃癌組織的Clusterin的表達陽性率是78.0%，正常胃黏膜組織中Clusterin的表達陽性率為26.0%，Clusterin在胃癌組織中的表達要顯著高于正常胃黏膜組織(P<0.05)；Caspase-3在胃癌組織中的陽性表達率為24.0%要顯著低于正常組織中的78.0%的表達，具有顯著地統計學差異(P<0.05)，見圖1～2，表1。

圖1 Western blot檢測組織中Clusterin和Caspase-3的表達

注：1，2號組織為隨機抽檢的正常胃黏膜組織，3，4號組織為隨機抽檢的胃癌組織

圖2 胃組織Clusterin和Caspase-3的免疫組化檢測(免疫熒光染色，400×)

組別Clusterin陽性(%)陰性(%)Caspase-3陽性(%)陰性(%)觀察組39(78．0)11(22．0)12(24．0)38(76．0)對照組13(26．0)37(74．0)39(78．0)11(22)χ2值15．32516．790P<0．05<0．05

2.2 Clusterin和Caspase-3的蛋白表達與受試者臨床指標、一般情況的聯系

見表2。

本研究發現，Clusterin蛋白的表達與受試者腫瘤的浸潤程度、胃癌組織學分型、是否淋巴結轉移以及TNM分期具有一定的統計學意義(P<0.05)，與患者的年齡、性別、腫瘤的大小無統計學意義(P>0.05)；Caspase-3的表達與受試者胃癌腫瘤浸潤程度、是否淋巴結轉移以及TNM分期具有一定的相關性(P<0.05)，與患者的年齡、性別、腫瘤的大小差異均無統計學意義(P>0.05)。

表2 Clusterin和Caspase-3的蛋白表達與受試者基本情況、疾病因素的聯系

2.3 Clusterin和Caspase-3在胃癌組織中的相關性

Spearman相關分析表明，在胃癌組織中Clusterin和Caspase-3蛋白表達呈顯著負相關，差異有統計學意義(P>0.05)，見表3。

表3 Clusterin和Caspase-3在胃癌組織中的相關性

3 討論

胃癌是人類最常見的惡性腫瘤中的一種，居全世界惡性腫瘤發病率和癌癥死亡率的第二位[4]。胃癌確診時，很多病人因為區域淋巴結轉移或是癌腫直接侵及周圍臟器而不能單純通過手術切除獲得治愈，而此類病人的預后很差，亟待進一步研究針對不能行外科手術的病人的治療方案，其中分子靶向藥物成為胃癌治療新的熱點和頗具前景的研究方向。目前的研究表明，胃癌的發展、轉移過程可能是由幾個關鍵基因調控，鑒別這類基因將有利于我們了解胃癌發展、轉移的分子機制，有利于集中及靶向治療腫瘤[5]。Clusterin是新發現的凋亡抑制因子，有研究發現其在許多的組織中都有表達，參與調控DNA修復，促進細胞周期進程，誘導細胞凋亡。最新研究發現，Clusterin可能具有抑制細胞凋亡的作用[6]。本研究結果顯示，Clusterin蛋白在胃癌組織區呈高表達狀態，其陽性表達率為78.0%，這提示我們Clusterin蛋白表達增高會抑制腫瘤細胞的凋亡，誘導其增殖。進一步研究結果還發現，Clusterin的表達與胃癌腫瘤浸潤深度、組織學分型程度、淋巴結轉移以及腫瘤TNM分期有關。這說明 Clusterin在腫瘤發展過程中扮演著重要的角色，其蛋白表達與腫瘤的惡性程度密切相關，我們可以通過檢測Clusterin的蛋白表達來探究胃癌的發展及預后。已有大量研究表明Caspase-3作為細胞凋亡進程中重要的調控因子參與到腫瘤的發展過程中。研究發現Caspase-3的低表達會解除對腫瘤細胞凋亡的調控作用，從而加速腫瘤細胞生長。本文發現，胃癌組織中Caspase-3的蛋白表達顯著低于正常胃黏膜組織，這與之前的研究結果一致[7]。進一步的研究發現：Caspase-3在有遠處轉移、低分化、浸潤胃黏膜深的胃癌中的陽性表達率更低，這些研究結果提示Caspase-3在胃癌的發生、發展中起重要作用，或可成為胃癌治療研究的新方向。本研究還發現，胃癌中Clusterin和Caspase-3的表達呈負相關，但在胃癌組織中Clusterin的表達升高與Caspase-3表達降低之間是否有聯系，目前尚未有報道，具體的作用機制還需通過實驗證明。綜上所述，Clusterin和Caspase-3的表達水平與胃癌的發生及發展關系密切，可以通過檢測這兩者在腫瘤組織中的表達來觀察腫瘤的發展進程，為藥物的研發和臨床治療手段提供了一定的理論基礎。

[1]陳振棟，張佳，劉振平，等.SDF1、CXCR7在胃癌中的表達及意義[J]. 黑龍江醫藥科學，2016,39(1)：96-97

[2]Koltai T. Clusterin: a key player in cancer chemoresistance and its inhibition[J]. Oncotargets & Therapy, 2013, 7(2):447-456

[3]Juraver-Geslin HA, Durand BC. Early development of the neural plate: new roles for apoptosis and for one of its main effectors caspase-3[J]. Genesis，2015，53(2): 203-224

[4]魏微微，孟凡石，張世英，等.Ki-67與RAB5A在胃癌中的表達[J]. 黑龍江醫藥科學，2015,38(2)：118-121

[5]LazR D C, T Ban S, Cornianu M, et al. New advances in targeted gastric cancer treatment[J]. World Journal of Gastroenterology, 2016, 22(30)：521

[6]Bi J，Guo AL，Lai YR，et al. Overexpression of clusterin correlates with tumor progression， metastasis in gastric cancer： A study on tissue mi croarrays [J]. Neoplasma， 2010， 57(3)： 191-197

[7]劉勇, 史立軍, 孟憲紅,等. PUMA、caspase-3蛋白在胃癌組織中的表達及其臨床意義[J]. 胃腸病學和肝病學雜志, 2010, 19(11):972-974

佳木斯大學研究生科技創新項目，編號：YM2016_013。

李衛(1991～) 男，安徽亳州人，在讀碩士研究生。

焦成斌(1965～)男，黑龍江佳木斯人，碩士，主任醫師，教授，碩士研究生導師。E-mail:JiaoChengBin@sina.com。

R735.2

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1008-0104(2017)06-0056-02

2017-02-28)