基于向量-子空間夾角判據分析飲料中的咖啡因

忻欣，劉柳，韓瑩，徐傳杰，粟暉，姚志湘

（1.西派特（北京）科技有限公司，北京100029；2.廣西科技大學生物與化學工程學院，廣西柳州545006；3.廣西壯族自治區計量檢測研究院，廣西南寧530007）

基于向量-子空間夾角判據分析飲料中的咖啡因

忻欣1，劉柳2，*，韓瑩1，徐傳杰3，粟暉2，姚志湘2

（1.西派特（北京）科技有限公司，北京100029；2.廣西科技大學生物與化學工程學院，廣西柳州545006；3.廣西壯族自治區計量檢測研究院，廣西南寧530007）

基于"向量-子空間夾角"判據，建立了飲料中咖啡因的快速分析方法。通過色譜-光譜聯用采集功能飲料和碳酸飲料的紫外多波長光譜三維數據，構建不含被測組分咖啡因的功能飲料和可樂三維本底光譜數據庫，基于向量-空間夾角法步驟測定了批量飲料樣本中咖啡因含量。結果表明：該方法計算結果和高效液相色譜分析結果接近，相對誤差小于4.0%，市售樣品加標回收率在96.7%～106.0%，RSD值小于2.0%。分析模型建立后，只需采集飲料的紫外光譜即可完成分析。建立的方法快速、準確，可為飲料的現場分析提供可行方案。

向量-子空間夾角；判據；咖啡因；飲料

咖啡因（C8H10N4O2）是一種黃嘌呤生物堿化合物，具有擴張血管，興奮中樞神經等功能。咖啡因被廣泛添加到功能型飲料和可樂型飲料中，其含量是衡量飲料品質的重要指標。

咖啡因的分析檢測，通常采用的有紫外分光光度法[1]、高效液相色譜法[2-3]、近紅外光譜法[4]和拉曼光譜法[5]等。高效液相色譜法具有操作簡便、靈敏度高等優點，但存在分離時間長，大批量樣本的分析效率低、操作強度大、試劑損耗大，分析成本高，紫外光譜法對于多組分同時有紫外響應的體系難以準確定量分析，近紅外光譜分析需要進行大量模型建立工作，因此有必要研究一種快速簡便的分析方法。近年來分析化學已經不再是依賴物質消耗手段來獲取信息，而是逐步發展成為化學信息科學[6]。目前的化學計量學研究對穩健性的關注主要在于樣本數據的多態和異常值（multimodality，outliers）[7]，建模樣本直接關系到模型的穩健性，即使是相同體系，在很多情況下模型對數據變化敏感，也就是說，穩健性仍然是一個關鍵問題[8]。

姚志湘等提出基于體系對應的子空間判斷比基于樣本的矩陣特征判斷具有更好的穩健性。當被測組分存在于體系時，該組分向量與體系子空間的夾角為零，反之夾角存在，向量-子空間夾角是一個子空間判斷依據。基于該判據，提出了一種混合一維譜的定量方法，在化妝品中對羥基苯甲酸酯[9-10]、醬油中山梨酸鉀[11]以及果凍中的色素和防腐劑[12]等測定中應用，分析速度快，測定結果的精密度和準確度滿足定量分析要求。方法不需要嚴格的秩估計，對樣本背景波動不敏感，具有較好的穩健性。

本文首先構建咖啡因標準紫外光譜數據庫和飲料紫外光譜數據，然后通過對市售不同功能性飲料進行一次高效液相色譜-光譜儀聯用，采集各樣品經色譜分離后的三維紫外光譜數據，經數據處理獲得不含被測組分咖啡因的本底光譜數據陣列，結合空間夾角判據算法（簡稱VS法）可實現直接分析待測樣本中咖啡因含量。

1 儀器與試劑

2 實驗部分

2.1 建立咖啡因標準品的標準光譜庫（v）

分別精確稱取0.020 0 g咖啡因標準品于25mL容量瓶中，用二次蒸餾水定容。分別稀配制成系列濃度為 4、6、8、10、12、14、16、18、20μg/mL 的咖啡因標準品溶液B1-B9，并采集多波長紫外光譜，經最小二乘回歸得到標準光譜庫v。

2.2 建立功能飲料、可樂樣本的光譜數據（a）

分別取市售可樂樣品1和可樂樣品2超聲20分鐘脫氣后，用二次蒸餾水稀釋10倍，得到待測（可樂）樣本S1和S2，另取功能性飲料用二次蒸餾水稀釋20倍得到S3。用紫外-可見光纖光譜儀采集200 nm～1 100nm多波長光譜數據，即獲得樣本光譜數據a1-a3。

2.3 建立飲料本底光譜數據庫（N）

對待測樣品S1-S3和咖啡因標準品B5，通過液相色譜與光譜儀聯用，采集各樣本經過色譜柱完全分離后的多波長光譜數據。從待測樣品光譜數據中扣除待測組分咖啡因的光譜數據，并經數據降維[5]，得到本底光譜數據庫N。

液相色譜條件：Agilent C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；柱溫：30℃；270 nm；

流動相為

0.01min～13.00min，乙腈：0.02mol/LH3PO4-NaH2PO4（pH：2.6）=15 ∶85（體積比）；13.01min～25.00min，乙腈：0.02 mol/L CH3COONH4（pH：6.5）=15∶85（體積比）；25.01min～45.00min，乙腈：0.02 mol/L H3PO4-NaH2PO4（pH：2.6）=35∶65（體積比）；45.01min～60.00min，乙腈：0.02mol/L CH3COONH4（pH：6.5）=40∶60（體積比）。

婦科共有30名護理人員,護理人員均為女性,年齡范圍20~35歲,平均(27.5±5.4)歲,工作時間1~14年,平均(7.5±1.9)年,學歷在本科以上20人(66.6%)、專科5人(16.7%)、中專5人(16.7%),其中副主任護師3人,護士主管10人,護師及護士共17人。

柱溫：30 ℃；流速 1mL/min；進樣量：20 μL。

紫外-可見光纖光譜儀光譜條件：流動比色皿（1 cm）；積分時間：15微秒；積分次數：20次；紫外檢測波長：200 nm～400 nm。

2.4 待測樣本中咖啡因含量測定

將上述標準光譜數據庫v，本底光譜數據庫N以及a導入計算平臺，選取200 nm～400 nm波長段，應用向量-子空間夾角判據算法分別計算各待測樣本中咖啡因的含量。

2.5 加標回收率試驗

將功能飲料樣品稀釋20倍，將可樂樣品稀釋10倍后，分別加入一定量的咖啡因標準品，測定其多波長紫外光譜數據，采用向量-子空間夾角判據計算樣品加標回收率。

2.6 精密度試驗

取稀釋后的功能飲料和可樂樣品，在紫外-可見光纖光譜儀上檢測重復測定3次，記錄紫外-可見光譜數據，用向量-子空間法進行計算，檢驗方法的精密度。

3 結果與討論

3.1 建立咖啡因標準品的標準光譜庫

選擇220 nm～350 nm波長范圍光譜，對系列濃度為4μg/mL～20μg/mL的咖啡因標準品溶液的紫外光譜進行多變量最小二乘回歸（Multivariate least-squares regression），得到咖啡因標準曲線，記為V。其中在270 nm處的線性方程、相關系數為：y=0.051 5x+0.030 3；r=0.999 1。

3.2 本底數據庫的建立

圖1、2、3分別為咖啡因對照品、功能飲料樣本和可樂樣品1樣本在270 nm處的高效液相色譜圖。經分析對比，圖2、3中A為咖啡因，其他的色譜峰為樣本中相對于咖啡因的本底物質。依次從各飲料樣本的數據中扣除與咖啡因標準物具有相同保留時間的光譜數據后，將其余數據存入光譜數據庫中構成數據庫M。

圖1 咖啡因對照品在270 nm處的高效液相色譜圖Fig.1 Caffeine reference substance at 270 nm of high performance liquid chromatography（HPLC）figure

圖2 功能飲料樣本的高效液相色譜圖Fig.2 Red bull samples of high performance liquid chromatography（HPLC）figure

圖3 可樂樣本的高效液相色譜圖Fig.3 Coke samples of high performance liquid chromatography（HPLC）figure

液相-光譜聯用獲取的初始本底光譜數據M數據量大，若直接采用，運算時間長，影響了方法的時效性，因此需要對獲取的數據進行降維以去除數據中的噪聲和冗余的維數，保留效性數據、并能夠提高算法的處理速度。以某品牌功能飲料飲料為例，選用主成分分析[13-14]的方法判斷體系主成份為5，如圖4所示。

圖4 二階差分序列變化圖Fig.4 Change of second difference successive value

應用[U，S，V]=svd（M）[6]對 M 進行奇異值分解降維，取降解后U矩陣的前5列，即為降維后的本地數據庫N。

3.3 樣品中咖啡因含量的測定

分別將本底光譜數據庫N、標準光譜數據庫v以及待測樣本a1、a2、a3導入計算平臺，應用向量-子空間夾角判據算法計算功能飲料樣本和可樂樣本中咖啡因含量，結果見表1。

表1 兩種方法測定市售飲料中咖啡因的含量Table 1 Two methods of determination of caffeine content in commercially available in drinks

續表1 兩種方法測定市售飲料中咖啡因的含量Continue table 1 Two methods of determination of caffeine content in commercially available in drinks

以功能飲料稀釋20倍后的樣品為例說明含量測定的計算過程。

（1）精度設定扣減步長Δ=1 000；

（2）在算式yi=aix+bi中代入較大的x1值，得到v1，所述的yi表示在i波長下咖啡因的吸光度值，ai、bi是常數，x表示咖啡因的濃度，v1表示在濃度為x1時咖啡因的多波長吸光度值y1，v1為所有的yi值組成的矩陣；

（3）從功能飲料樣本光譜數據a1中扣除v1/Δ，扣除后的變量記為da1；把本底光譜數據庫N和變量da1合并后記為對比空間M，計算對比空間M與v1夾角；

（4）從功能飲料樣本光譜數據a中逐步扣除v1后，重復步驟（3）；

（5）當功能飲料樣品中的咖啡因完全被扣除后比對空間M和咖啡因的光譜向量v，空間夾角值會出現最大值θmax，記錄空間夾角最大值θmax出現時對應的扣減步數λ（參見圖5出現最大夾角是的扣減步數為959），這時通過咖啡因的濃度x1和扣減步數λ，計算飲料樣本中咖啡因的含量y1=19.3×959/1 000，得到Y1即為待測飲料樣品中咖啡因的含量值18.5μg/mL。

圖5 功能飲料樣本空間夾角值與扣減次數之間的曲線圖Fig.5 Red bull vitamin drinks sample space angle values and curve between the numbers of deduction

從表1可知，采用向量-子空間夾角判據測定計算功能飲料、可樂樣品1、可樂樣品2中咖啡因含量，與高效液相色譜測定結果對比，相對誤差基本小于±4%，說明向量-子空間夾角判據方法測定結果準確。

3.4 精密度試驗結果

分別對功能飲料、可樂樣品1、可樂樣品2樣本連續采集5次多波長光譜數據，按向量-子空間夾角判據進行計算，5次測定樣品含量的平均值（C5）和相對標準偏差（RSD）如表2所示。試驗結果表明相對標準偏差RSD小于2%，方法精密度好。

3.5 咖啡因本底加標樣品的測定

在已知濃度的紅牛維生素飲料和可樂飲料中，添加一定量的咖啡因標準品，選擇210 nm～370 nm的紫外光譜進行空間夾角法進行運算，回收率為96.7%～106.0%，如表3所示，證明方法準確可靠。

表2 樣品的相對標準偏差（n=5）Table 2 Relative standard deviation of samples（n=5）

表3 加標回收率Table 3 The recoveries of standard caffeine

4 結論

建立的飲料中咖啡因的快速分析方法滿足定量分析需求，樣品不需要復雜的前處理，對于同類飲料的測定，一次建庫后無須再采用儀器聯用進行本底光譜累積，即可對樣品混合光譜中的待測組分進行快速、準確定量。方法具有操作簡便，試劑消耗量小的特點。

[1]孫延春,張英.紫外光譜法測定飲料中的咖啡因含量[J].化學研究,2011(1):77-79

[2]陳超,宋玉梅,梁慧,等.HPLC-DAD-CAD法同時測定功能性飲料中牛磺酸和咖啡因含量[J].安徽農業科學,2016(17):114-116

[3]曾誠,趙文惠.反相高效液相色譜和超高效液相色譜法測定飲料中咖啡因含量的比較研究[J].食品安全質量檢測學報,2015(6):2337-2341

[4]王冬,閔順耕,段佳,等.漫反射近紅外光譜法同時測定液體咖啡中的速溶咖啡、植脂末、糖含量[J].光譜學與光譜分析,2012(4):982-984

[5]彭軍,梁敏華,馮錦澎.常見飲料中咖啡因的拉曼光譜定性檢測[J].大學物理實驗,2011(3):29-31

[6]保羅·戈培林.化學計量學實用指南[M].2版.吳海龍,康超,譯.北京:科學出版社,2006:93,301

[7]Filzmoser P,Todorov V.Review of robust multivariate statistical methods in high dimension[J].Analytica Chimica Acta,2011,705(1/2):2-14

[8]梁逸曾,許青松,李洪東.化學建模中幾個基礎問題的點滴思考[C].蘭州:第十一屆全國計算(機)化學學術會議,2011

[9]粟暉,姚志湘,方鳳,等.化妝品中對羥基苯甲酸酯的快速測定方法:ZL 201310230203.5[P].2014.10.8

[10]粟暉,方鳳,姚志湘,等.基于HPLC-UV與空間夾角判據的化妝品中對羥基苯甲酸酯分析[J].計算機與應用化學,2014,31(5):611-614

[11]劉柳,粟暉,姚志湘,等.基于向量-子空間夾角判據測定果凍中的色素和防腐劑[J].食品研究與開發,2015(20):127-131

[12]粟暉,陳成,姚志湘.基于子空間夾角判據-UV法直接稀釋測定醬油中的山梨酸鉀[J].中國調味品雜志,2013,38(11):310-313

[13]QIA X,LUO R Y,ZHAO H Y.Sparse principal component analysis by choice of norm[J].Journal of Multivariate Analysis,2013,114:127-160

[14]姚志湘,蹇華麗,劉煥彬.多變量統計分析中獨立變量數目的判定方法[J].華南理工大學學報(自然科學版),2007,35(1):123-128

Determination of Caffeine in Drinks Based on Vector-subspace Angle Criterion

XIN Xin1，LIU Liu2，*，HAN Ying1，XU Chuan-jie3，SU Hui2，YAO Zhi-xiang2
（1.CSEPAT（Beijing）Technology Co.，Ltd.，Beijing 100029，China；2.Department of Biological and Chemical Engineering，Guangxi University of Science and Technology，Liuzhou 545006，Guangxi，China；3.Guangxi Zhuang Autonomous Region Institute of Metrology&Test，Nanning 530007，Guangxi，China）

According to Vector-subspace （VS）angle criterion，a new method of quick caffeine-analyzing in drinks is created.Using chromatography-mass spectrum analysis to collect UV multi-wavelength spectral databases of common functional drink and Cola，the background databases of functional drink and Cola without tested Caffeine were established，then Caffeine in Red Bulk and Cola was determinate based on Vector-subspace Angle Criterion.The results presented that analysis results were similar to that of High performance liquid chromatography（HPLC），the relative errors were less than 4.0%，the recoveries of standard caffeine which was added in Red bulk drink and Cola samples were in the range of 96.7%-106.0%and the relative stand deviation was less than 2.0%.After the background databases were established，the analysis could be achieved by only collecting the drinks'UV wavelength spectral.The method is rapid and accurate，which could provide the feasible solution to drinks'scene analysis.

vector-subspace；criterion；caffeine；HPLC；drink

忻欣，劉柳，韓瑩，等.基于向量-子空間夾角判據分析飲料中的咖啡因[J].食品研究與開發，2018，39（1）：126-130

XIN Xin，LIU Liu，HAN Ying，et al.Determination of Caffeine in Drinks Based on Vector-subspace Angle Criterion[J].Food Research and Development，2018，39（1）：126-130

10.3969/j.issn.1005-6521.2018.01.025

廣西重點研發計劃項目（桂科AB16380348）；柳州市計劃項目（2015J030201）

忻欣（1983—），女（漢），工程師，碩士，研究方向：食品科學與工程。

*通信作者：劉柳（1979—），女（漢），高級實驗師，碩士，研究方向：過程分析技術。

2017-06-11