HPLC分析測定不同茶葉中的游離氨基酸

（揚(yáng)州工業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，江蘇揚(yáng)州225127）

HPLC分析測定不同茶葉中的游離氨基酸

王富花

（揚(yáng)州工業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，江蘇揚(yáng)州225127）

分析檢測不同茶葉（綠茶，紅茶，烏龍茶）中游離氨基酸的組成。稱取0.25 g的茶葉于10mL 90℃純凈水中浸提20min后過0.45 μm纖維素膜，濾液通過固相萃取（solid phase extraction cartridges，SPE）柱預(yù)處理后得到茶湯樣品。取70 μL的樣品與10 μL的鄰苯二甲醛（OPA）衍生液在25℃水浴中反應(yīng)2min后通過高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）測定，色譜條件為C18柱，DAD檢測器，338 nm檢測波長，流動(dòng)相A為甲醇-乙腈-水溶液，流動(dòng)相B為磷酸鹽緩沖液。試驗(yàn)表明：通過SPE柱能有效去除影響色譜出峰的雜質(zhì)，HPLC方法能有效地分離測定茶葉中的17種不同氨基酸，綠茶中的氨基酸含量要比發(fā)酵茶高，尤其是天冬氨酸、谷氨酸，而茶氨酸在3種茶葉中的含量顯著不同。

氨基酸；高效液相色譜法；固相萃取；茶葉

茶圣陸羽《茶經(jīng)》中精論：“茶之為用，味之寒，為飲為最，精行儉德之人，若熱渴、凝悶、腦疼、目澀、四肢煩、百節(jié)不舒，聊四五啜，與醍醐甘露抗衡也。”茶葉根據(jù)加工方法不同，有紅茶、綠茶、青茶（烏龍茶）、白茶、黃茶和黑茶六大基本茶類[1]。紅茶在世界范圍內(nèi)暢銷，而綠茶和烏龍茶的消費(fèi)地區(qū)主要是在亞洲和北非[2]。茶葉中主要含有茶多酚、生物堿、茶多糖、茶色素、維生素、氨基酸、礦物質(zhì)元素等[3]。其中氨基酸有20多種，它們是茶葉主要的鮮爽滋味成分，對(duì)茶葉的香氣形成以及湯色起重要作用。

氨基酸是茶葉中具有氨基和羧基的有機(jī)化合物，是茶葉中的主要化學(xué)成分之一。茶葉中的氨基酸，不僅是組成蛋白質(zhì)的基本單位，也是活性肽、酶和其他一些生物活性分子的重要組成成分。茶葉氨基酸的組成、含量以及它們的降解產(chǎn)物和轉(zhuǎn)化產(chǎn)物也直接影響茶葉品質(zhì)[4]。氨基酸在茶葉加工中參與茶葉香氣的形成，它所轉(zhuǎn)化而成的揮發(fā)性醛或其他產(chǎn)物，都是茶葉香氣的成分[5]。此外，有些氨基酸本身也具有一定的香味，特別是某些氨基酸與茶葉的滋味及香氣關(guān)系密切，是構(gòu)成綠茶品質(zhì)的極重要的成分之一。由于茶葉中氨基酸對(duì)茶葉品質(zhì)有重要作用，多年來備受重視。

中性氨基酸包括甘氨酸、丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、半氨酸、絲氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸等。其中甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸為必需氨基酸，在茶葉滋味的協(xié)調(diào)中具有重要作用。酸性氨基酸主要包括谷氨酸和天冬氨酸，它們是茶葉中最重要的一類氨基酸，在茶葉中的含量高，是構(gòu)成茶葉鮮爽滋味的重要成分[6]。堿性氨基酸茶葉中主要有精氨酸和賴氨酸。

茶氨酸是茶葉中的特征游離氨基酸，它具有鮮爽滋味，對(duì)茶葉的香氣形成以及湯色起重要作用[7]。近年來茶葉中茶氨酸的研究內(nèi)容包括茶氨酸在各種茶葉中的分布；茶氨酸的體內(nèi)代謝機(jī)制及其生理功能；茶氨酸的提取、檢測方法（氨基酸分析儀法、高效液相色譜法、毛細(xì)管電泳法等）；以及茶氨酸在食品領(lǐng)域的應(yīng)用等。大量研究表明，茶葉中的氨基酸具有促進(jìn)大腦功能和神經(jīng)的生長、降壓安神、抗腫瘤等生理功能。

本實(shí)驗(yàn)采用高效液相色譜法，結(jié)合SPE柱對(duì)茶湯的預(yù)處理，對(duì)茶葉中游離氨基酸的檢驗(yàn)測定，有利于進(jìn)一步地進(jìn)行茶葉中氨基酸的定量分析。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)器材

RE-5286A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器廠；HH-2型電熱數(shù)顯恒溫水浴鍋：常州金壇市科興儀器廠；Sep-Pak Cartridges固相微萃取柱（SPE）：美國 Waters公司；AgilentZORBAXEclipseXDB-C18柱（4.6mm×15 mm×5 μm）：美國 Agilent公司。

1.2 試驗(yàn)試劑

乙醇：上海中試化工總公司；甲醇：江蘇漢邦科技有限公司；磷酸氫二鈉：上海凌峰化學(xué)試劑有限公司；鄰苯二甲醛：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.3 樣品與標(biāo)準(zhǔn)品

1.3.1 茶樣

綠茶（信陽毛尖，河南信陽）；烏龍茶（凍頂烏龍，臺(tái)灣）；紅茶（祁門紅茶，安徽）。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)氨基酸樣品

L-蘇氨酸（L-Thr），L-賴氨酸（L-Lys），L-苯丙氨酸（L-Phe），L-精氨酸（L-Arg），L-甲硫氨酸（L-Met），L-組氨酸（L-His），L-甘氨酸（L-Gly），L-天冬酰胺（LAsn），L-絲氨酸（L-Ser），L-亮氨酸（L-Leu），L-異亮氨酸（L-Ile），L-丙氨酸（L-Ala），L-天冬氨酸（L-Asp），L-色氨酸（L-Trp），L-酪氨酸（L-Tyr），純度均≥99.0%：西寶生物科技（上海）股份有限公司；茶氨酸（L-Thea）：上海撫生實(shí)業(yè)有限公司；谷氨酸（L-Glu）：上海宸功生物技術(shù)有限公司。

1.4 方法

1.4.1 試劑的配制

1）甲醇-乙腈-水流動(dòng)相：體積比 45∶45∶10 混合。

2）40 mmol/L磷酸鹽緩沖液：用鹽酸調(diào)節(jié)pH至7.5～7.6。

3）OPA衍生劑：取5mgOPA試劑，依次加入0.05mL甲醇、0.45mL 硼酸鈉溶液（0.4 mol/L）、0.025mL β-巰基乙醇，混合均勻。

1.4.2 標(biāo)準(zhǔn)氨基酸樣液的制備

1）標(biāo)準(zhǔn)氨基酸純樣液的制備：取標(biāo)準(zhǔn)氨基酸樣品1mg溶于1mL純凈水，得1mg/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液。

2）標(biāo)準(zhǔn)氨基酸混樣液的制備：將17種標(biāo)準(zhǔn)氨基酸的純樣液按照一定比例混合制備而成。

1.4.3 茶樣的制備

1）初始茶樣的制備：取祁門紅茶0.25 g浸入10mL沸水中，于90℃恒溫水浴20min，取出后過濾，濾液過0.45 μm纖維素膜得到初始茶樣。

2）SPE柱的活化：先用30mL的甲醇通過SPE柱（速度控制在1mL/min左右），再用10mL水將甲醇洗凈。

3）初始茶樣的SPE柱處理：取制備的初始茶樣過SPE柱，接取1mL后用5 mL10%乙醇溶液再次洗脫，將兩次的洗脫液合并后，將合并的溶液置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中旋轉(zhuǎn)蒸干，用1mL純凈水復(fù)溶，復(fù)溶液過0.45 μm纖維素膜得到用于HPLC檢測的茶樣品溶液。

1.4.4 氨基酸的柱前衍生化反應(yīng)

取樣液70 μL與OPA衍生液10 μL于25℃恒溫水浴中準(zhǔn)確反應(yīng)2min。

1.4.5 氨基酸的檢測方法

1）儀器條件：采用ZORBAX Eclipse XDB-C18色譜柱；DAD檢測器，338 nm紫外檢測波長；進(jìn)樣量為20 μL；柱溫為40℃；流動(dòng)相A為甲醇-乙腈-水溶液，流動(dòng)相B為40 mmol/L磷酸鹽緩沖液，pH7.5；流速為1mL/min。

2）洗脫梯度如表1。

表1 HPLC流動(dòng)相的洗脫梯度Table 1 The elution gradient of the mobile phase of HPLC

1.4.6 標(biāo)準(zhǔn)氨基酸的HPLC檢測方法

1.4.6.1 標(biāo)準(zhǔn)氨基酸純樣液的HPLC檢測

取標(biāo)準(zhǔn)氨基酸樣品，OPA衍生化后，進(jìn)行HPLC測定。

1.4.6.2 標(biāo)準(zhǔn)氨基酸混樣液的HPLC檢測

取標(biāo)準(zhǔn)氨基酸混合樣品進(jìn)行試驗(yàn)，方法如1.4.6.1。

1.4.6.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

分別取17種標(biāo)準(zhǔn)氨基酸樣品（1mg/mL）配制成以 下 反 應(yīng) 濃 度 梯 度 ：0.05、0.025、0.005、0.002 5、0.001 25mg/mL，衍生化后按照上面的色譜條件進(jìn)行HPLC檢測，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程。

1.4.7 茶葉樣品的HPLC檢測方法

使用不同濃度，不同量的乙醇洗脫液SPE處理的綠茶的HPLC檢測、經(jīng)過SPE柱處理的祁門紅茶的HPLC檢測以及未經(jīng)過SPE處理的烏龍茶的HPLC檢測均參考文獻(xiàn)[8-9]報(bào)道的方法。

1.4.8 檢測限（LOD），定量限（LOQ），回收率值的測定

d：標(biāo)準(zhǔn)曲線y軸截距的標(biāo)準(zhǔn)偏差

s：標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率的平均值。

稱取一定量的標(biāo)準(zhǔn)氨基酸樣品在衍生化反應(yīng)后通過HPLC法測定其含量，測定值與真實(shí)值的比值為HPLC方法的回收率測定值。同理，測定SPE柱方法的回收率。計(jì)算LOD及LOQ值，標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作需要平行測定3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 HPLC方法的確立

17種標(biāo)準(zhǔn)氨基酸混合樣品經(jīng)HPLC檢測的色譜圖如圖1所示。

圖1 17種標(biāo)準(zhǔn)氨基酸混樣經(jīng)HPLC檢測的色譜圖Fig.1 Chromatogram of 17 standard amino acid mixed samples by HPLC

色譜圖中，任意相鄰兩個(gè)色譜峰的分離度都大于1.8，而分離度等于1.5為相鄰兩峰完全分開的標(biāo)志[7]。由色譜圖測定17種氨基酸的保留時(shí)間如表2。

2.2 不同品種茶樣的色譜圖

未經(jīng)過SPE柱處理和經(jīng)過SPE柱預(yù)處理的綠茶色譜圖如圖2所示。

圖3表示的是經(jīng)SPE柱預(yù)處理的紅茶的色譜圖。

圖4表示的是未經(jīng)SPE柱預(yù)處理的烏龍茶的色譜圖。

上述色譜圖可以進(jìn)行茶葉（信陽毛尖、凍頂烏龍、祁門紅茶）中游離氨基酸組分的定性分析。從圖2中可以發(fā)現(xiàn)茶樣通過SPE柱處理后可以有效地除去雜質(zhì)峰，這些雜質(zhì)的保留時(shí)間在14min～19min內(nèi)，并且在3種SPE預(yù)處理的方法中，使用5 mL10%的乙醇效果最好，能夠?qū)⒈籗PE柱內(nèi)固定相吸附的氨基酸洗脫下來，從而減少試驗(yàn)誤差。圖3、圖4比較發(fā)現(xiàn)茶鮮葉經(jīng)過不同程度的發(fā)酵制成烏龍茶、紅茶后，氨基酸的種類基本沒有變化。

表2 17種氨基酸的出峰順序及保留時(shí)間Table 2 17 peaks of amino acids and retention time

續(xù)表2 17種氨基酸的出峰順序及保留時(shí)間Continue table 2 17 peaks of amino acids and retention time

2.3 茶葉中游離氨基酸的定量分析

信陽毛尖，祁門紅茶，凍頂烏龍茶中游離氨基酸的含量如表3所示。

圖2 不同預(yù)處理的綠茶色譜圖Fig.2 Different pretreatment of green tea chromatograms

圖3 SPE柱預(yù)處理的紅茶的色譜圖Fig.3 SPE column pretreatment of black tea

氨基酸是構(gòu)成茶湯鮮爽滋味的主體成分，某些氨基酸如谷氨酸、苯丙氨酸也具有一定的芳香。眾多的研究結(jié)果均表明，綠茶中的氨基酸含量與品質(zhì)呈顯著的正相關(guān)，氨基酸含量高，綠茶品質(zhì)好[7]。

圖4 未經(jīng)SPE柱預(yù)處理的烏龍茶的色譜圖Fig.4 Chromatogram of oolong tea pretreated without SPE column

表3 信陽毛尖，祁門紅茶，凍頂烏龍茶中游離氨基酸的含量Table 3 The content of free amino acids in Xinyang Maojian，Qimen black tea and frozen top oolong tea

有資料表明，信陽毛尖的氨基酸含量以茶氨酸最高，占總量的70%以上，其次是谷氨酸、天冬氨酸、絲氨酸[10]。試驗(yàn)結(jié)果則表明，不管何種茶葉，茶氨酸的含量占絕對(duì)的優(yōu)勢(shì)。信陽毛尖中，天冬氨酸、天冬酰胺、組氨酸，精氨酸的含量比較高，丙氨酸未檢測出。祁門紅茶中氨基酸的含量比較均衡，天冬酰胺、組氨酸的含量較高，而甘氨酸未檢測出。凍頂烏龍茶中天冬酰胺和天冬氨酸的含量較高，甘氨酸未檢出。烏龍茶為半發(fā)酵茶，但除天冬氨酸外，其余種類的氨基酸含量均比祁門紅茶中的氨基酸含量低。

氨基酸在紅茶制造中的變化比較復(fù)雜。在紅茶制造的萎凋階段明顯增加，以后各工序又逐漸減少。在紅茶制造的萎凋、揉捻和發(fā)酵階段，由于酶或鄰醌的作用，可使氨基酸氧化成醇、醛類香氣。氨基酸除本身偶聯(lián)氧化形成紅茶香氣物質(zhì)醇、醛外，還是紅茶加工中許多芳香物質(zhì)形成的先質(zhì)[11]。

茶鮮葉經(jīng)過發(fā)酵制成紅茶，氨基酸在種類上來說是基本沒有變化的，但是從各種氨基酸的數(shù)量來說，烏龍茶和紅茶都比鮮葉低，說明發(fā)酵過程中氨基酸的降解作用是顯著的[12]。

2.4 LOD、LOQ、回收率值

LOD、LOQ、回收率值的測定結(jié)果如表4所示。

表4LOD、LOQ、回收率測定值Table 4 LOD，LOQ and recovery rate

LOD 值為 3.4ng～28.6ng，LOQ 值為 11.8ng～94.6ng。HPLC方法的回收率值中，Thr的得率是最低的，為89.8%，其余的各種氨基酸的回收率都在90%以上，說明HPLC的測定方法較好。試驗(yàn)過程中，如果將茶湯直接通過SPE柱后，會(huì)有部分氨基酸被SPE柱的固定相吸附，導(dǎo)致氨基酸未被檢出。改進(jìn)試驗(yàn)方法后，茶湯通過SPE柱后，再用5 mL10%的乙醇溶液再次洗脫，將兩次洗脫液合并后檢測，能夠正常檢測出應(yīng)有的氨基酸成份，并且SPE柱方法的回收率在89.3%～112.5%，說明該方法是有效的。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)主要研究了HPLC法分析綠茶、紅茶和烏龍茶中的游離氨基酸的組成，使用了SPE柱進(jìn)行茶湯樣品的預(yù)處理，擴(kuò)大了SPE柱的使用范圍，并且效果較好。SPE柱和HPLC方法的回收率測定值均在89%以上，能夠一次性檢測出茶葉樣品中的17種氨基酸。氨基酸的種類在3種茶葉中差別不大，但數(shù)量差異明顯，綠茶中的氨基酸含量比發(fā)酵茶要多，尤其是綠茶中的酸性氨基酸和堿性氨基酸的含量較高，說明發(fā)酵過程中這兩類氨基酸的降解作用是明顯的。而祁門紅茶中的氨基酸除了天冬氨酸和谷氨酸外，其余的氨基酸含量都要比烏龍茶多。

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Analysis and Determination of Free Amino Acids in Different Tea by HPLC

WANG Fu-hua
（Yangzhou Polytechnology Institute，Yangzhou 225127，Jiangsu，China）

The composition of free amino acids in different tea （green tea，black tea and oolong tea）is analyzed.Each dried pretreated tea（0.25 g）was extracted by 10mL pure water in a designed temperature（90 ℃），extraction time 20min.then filtrated through 0.45 μm cellulose membrane，pretreated by SPE column.Take 70 μL samples and 10 μL O-phthalaldehyde（OPA）derivatization liquid in water bath reaction at a temperature of 25℃，2 minutes later were determined by high performance liquid chromatography（HPLC），chromatographic condition was performed on a C18column，DAD detector，detection wavelength was 338 nm.The mobile phase A was the methanol acetonitrile water solution，and the mobile phase B was the phosphate buffer solution.The results showed that the solid phase extraction cartridges（SPE）column treatment could effectively remove the influence of chromatographic peaks of impurities，and the HPLC method could be effective for the separation and determination of 17 kinds of amino acids in different tea，the content of amino acid in green tea was higher than fermented tea，especially aspartic acid，glutamic acid，and the content of L-Theanine in three kinds of tea was significantly different.

amino acid；HPLC；SPE；tea

王富花.HPLC分析測定不同茶葉中的游離氨基酸[J].食品研究與開發(fā)，2018，39（1）：141-146

WANGFuhua.AnalysisandDeterminationofFreeAminoAcidsinDifferentTeabyHPLC[J].FoodResearchand Development，2018，39（1）：141-146

10.3969/j.issn.1005-6521.2018.01.028

王富花（1976—），女（苗），副教授，碩士，研究方向：天然產(chǎn)物提取分離純化。

2017-05-25