褪黑素誘導NB4細胞凋亡及機制的研究

楊松柳，劉媛媛，金松根，趙鳴雁

褪黑素誘導NB4細胞凋亡及機制的研究

楊松柳，劉媛媛，金松根，趙鳴雁*

目的探討褪黑素對NB4細胞凋亡的增殖抑制和凋亡誘導作用。方法將0、10-8、10-6、10-4mol/L褪黑素在體外與NB4細胞共同培養，應用噻唑藍(MTT)比色法測定細胞活性，Hoechst熒光染色檢測細胞凋亡，流式細胞技術檢測凋亡細胞比例，分光光度計檢測上清液中Caspase-3及Caspase-9含量。結果褪黑素能顯著抑制NB4細胞增殖，促進細胞凋亡，增加凋亡因子的表達。結論褪黑素促進NB4細胞凋亡的機制可能與增加Caspase-3及Caspase-9表達有關。

褪黑素；NB4細胞；凋亡；Caspase-3；Caspase-9

0 引言

傳統化療藥物通過抑制白血病腫瘤細胞增殖，促進其凋亡發揮治療作用，但由此帶來的對正常細胞的毒副作用不容忽視[1-3]。因此，應尋找一種低毒、安全、不良反應小的藥物替代或輔助現有治療藥物，達到減少耐藥性、降低不良反應的目的。褪黑素是一種由松果體分泌的具有強抗氧化能力的自由基清除劑，作為一種生物類激素，褪黑素由人體自身合成并分泌，其安全性得到保證。劉沁華等[4]研究顯示，褪黑素聯合全反式維甲酸可以抑制人早幼粒細胞白血病細胞株HL-60細胞的增殖，促進其凋亡，誘導其分化，從而延緩病情發展；曾慶曙等[5]研究顯示，褪黑素能維持胰島細胞的正常生理功能和生化指標，促進NB4細胞的凋亡，但作用的具體機制尚不清楚。本研究通過觀察褪黑素對人急性早幼粒白血病細胞株NB4細胞的增殖抑制作用并探討相關機制，希望為白血病的治療提供新的藥物選擇。

1 材料與方法

1.1 主要材料 褪黑素(美國Sigma公司，純度97%)，青霉素、鏈霉素(華北制藥公司)，RPMI 1640培養基(美國Hyclone公司)，四甲基偶氮唑鹽(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide,MTT,Sigma公司)，AnnexinV FITC/PI凋亡試劑盒(美國BD公司)，Caspase-3、Caspase-9酶檢測試劑盒(江蘇碧云天生物技術研究所)，酶標儀(上海精密科學儀器有限公司)，流式細胞儀(美國BD公司)。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 NB4細胞培養在含有10%胎牛血清的RPMI 1640培養基內，培養箱內溫度37 ℃，CO2體積分數5%，細胞貼壁生長，取對數生長期的細胞進行實驗。

1.2.2 細胞增殖檢測 采用MTT法，NB4細胞接種于96孔板中(3×104個，200 μL/孔)，設4個復孔，分別加入0、10-8、10-6、10-4mol/L褪黑素，細胞培養24 h后，換掉培養液，PBS沖洗3次后加入體積分數為0.5%的MTT溶液20 μL，溫育4 h，棄上清液加入100 μL DMSO溶液，室溫下搖床低速震蕩20 min后全自動酶標光度儀測定各孔490 nm的光密度值(OD值)，實驗重復3次。

1.2.3 細胞凋亡率的流式細胞術檢測 按“1.2.2”項分組方法將細胞培養在6孔板中，收集各處理組NB4細胞，PBS洗滌2次后，1 200 r/min離心棄上清液，用試劑盒中的緩沖液懸浮細胞，分別加入FITC-Annexin Ⅴ和PI染液各5 μL，溫箱孵育20 min后離心棄上清。于避光環境內PBS洗滌2次后上流式細胞儀進行細胞凋亡檢測。

1.2.4 細胞凋亡的Hoechst 33285熒光染色測定 取對數生長期細胞，用PBS洗滌2次，在150 μL的Binding Buffer中加入2 μL Hoechst染液，避光、室溫反應5 min后置于熒光顯微鏡下觀察，放大倍數為400倍。

1.2.5 Caspase-3、Caspase-9活性檢測 采用分光光度法，按“1.2.2”項方法處理細胞，收集細胞并用0.1%胰酶消化，1 200 r/min離心10 min，收集細胞并用PBS沖洗2次，加入30 μL細胞裂解液后冰上孵育20 min，10 000 r/min離心10 min，進行Caspase活性檢測。檢測方法按試劑盒進行。Caspase活性=OD405 nm/OD595 nm。

2 結果

2.1 不同濃度褪黑素對NB4細胞增殖的抑制作用 陰性對照組NB4細胞活性為(101.00%±3.02%)，用不同濃度褪黑素處理后，細胞活性分別下降到76.33%±2.04%、59.67%±3.52%和46.67%±3.21%，與陰性對照組比較差異有統計學意義(P<0.05)。見圖1。

2.2 流式細胞計數檢測褪黑素對NB4細胞凋亡的影響 流式細胞計數檢測結果顯示，NB4細胞經過0、10-8、10-6、10-4mol/L褪黑素處理后，細胞凋亡率分別為2.11%±0.54%、25.76%±2.97%、33.72%±2.86%和47.53%±3.05%，隨著褪黑素濃度的增加，NB4細胞凋亡比例逐漸增加。見圖2。

圖1 褪黑素對NB4細胞活性的影響

2.3 Hoechst 33285核染色法檢測各組NB4細胞凋亡 在熒光顯微鏡下，凋亡細胞核或細胞質內可見濃染致密的顆粒狀高熒光，未發生凋亡的細胞核呈均勻淡黑色低熒光。本實驗顯示，陰性對照組(2.00%±1.11%)未見明顯凋亡染色的細胞核，不同濃度的褪黑素處理后，凋亡細胞比例逐漸增加(29.08%±3.34%、36.00%±2.07%、56.73%±4.52%)，與陰性對照組凋亡細胞比例比較差異有統計學意義(P<0.05)。見圖3、圖4。

2.4 褪黑素對NB4細胞內Caspase-3、Caspase-9含量的影響 加入褪黑素作用后，NB4細胞內Caspase-3、Caspase-9表達較陰性對照組顯著增加，差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 各組NB4細胞內Caspase-3、Caspase-9含量(n=3)

注：與陰性對照組比較，*P<0.05,**P<0.01

圖2 褪黑素對NB4細胞凋亡的影響

圖3 褪黑素對NB4細胞凋亡的影響

圖4 各組細胞凋亡率比較

3 討論

白血病的治療機制為通過藥物誘導腫瘤細胞凋亡[6]。白血病有很多分類，不同類型的白血病對化療敏感性不同，化療可以使部分白血病患者病情得到緩解，但是由于化療過程中腫瘤細胞長期與藥物接觸，逐漸產生耐藥性，影響化療效果及患者生存率[7]。因此，研發出一種自然低毒、不良反應少的抗腫瘤藥物已經成為治療的新方向。

通過研究藥物誘導腫瘤細胞凋亡的影響，不但可以為腫瘤的防治提供新的理論依據，還可以進一步探索腫瘤細胞的生長規律，進一步指導臨床治療。褪黑素化學名稱為5-甲氧基-N-乙酰色胺，具有廣泛的生物學效應，其基本功能包括調節晝夜節律、情緒及睡眠[7-8]。褪黑素具有雙向作用機制：對于正常細胞，褪黑素能抑制其凋亡，對于腫瘤細胞，褪黑素能誘導其凋亡。臨床上褪黑素也被廣泛應用于神經系統、內分泌系統、消化系統疾病的治療[9-11]。近年來有人將其用于白血病的治療上，也取得一定效果。本實驗通過MTT分析細胞活性發現褪黑素能夠劑量依賴性地抑制NB4細胞活性。Hoechst 33285核染色法是一種定量檢測細胞凋亡的實驗方法，可以直觀發現凋亡細胞的形態，并初步評估凋亡細胞數量。本研究結果顯示，NB4細胞經過褪黑素干預后，細胞核內染色質固縮呈致密濃染的亮藍色高熒光，表明褪黑素誘導了NB4細胞凋亡。流式細胞計數結果進一步驗證了褪黑素能夠誘導NB4細胞凋亡。

腫瘤的形成是腫瘤細胞增殖與凋亡比例失衡的結果。凋亡過程中有許多蛋白酶的參與，其中Caspase家族蛋白酶在其中發揮重要作用[12]。有研究顯示，褪黑素可以使人B淋巴母細胞瘤細胞胞內Caspase-3表達增加，進而誘導B淋巴母細胞瘤凋亡[13]。本研究結果與其相似，褪黑素處理后的NB4細胞內Caspase-3及Caspase-9的表達均升高，證實了褪黑素對NB4細胞凋亡的促進作用。

綜上所述，褪黑素可以誘導NB4細胞凋亡，其抑制作用呈量-效相關性，為該藥物應用于臨床白血病的治療提供了理論依據。

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MelatonininducedtheapoptosisofNB4cellsanditsmechanism

YANG Song-liu,LIU Yuan-yuan,JIN Song-gen,ZHAO Ming-yan*

(the Critical Care Medicine,First Affiliated Hospital of Harbin Medical University,Harbin 150001,China)

ObjectiveTo investigate the effect of melatonin on the proliferation inhibition and apoptosis induction of NB4 cells.MethodsNB4 cells and 0,10-8,10-6and 10-4mol/L melatonin were cultured togetherinvitro.The cell viability was measured by MTT colorimetric assay;the apoptosis was detected by Hoechst fluorescent staining,and the rate of apoptosis cells were measured by flow cytometry;the contents of Caspase-3 and Caspase-9 in supernatant were checked by spectrophotometer.ResultsMelatonin significantly inhibited NB4 cell proliferation,promoted cell apoptosis,and increased the expression of apoptosis factors.ConclusionThe mechanism of melatonin promoting the apoptosis rate of NB4 cells may be related to increasing the expression of Caspase-3 and Caspase-9.

Melatonin;NB4 cell;Apoptosis;Caspase-3;Caspase-9

2017-05-30

哈爾濱醫科大學附屬第一醫院重癥醫學科，哈爾濱 150001

國家自然科學基金(81171785)

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10.14053/j.cnki.ppcr.201712006