VTQ和超聲微泡造影技術(shù)對大鼠肝纖維化的評估價值研究

劉芳 黃斌

VTQ和超聲微泡造影技術(shù)對大鼠肝纖維化的評估價值研究

劉芳 黃斌

目的 探討聲觸診組織量化技術(shù)（VTQ）和超聲微泡造影技術(shù)對大鼠肝纖維化的評估價值。方法 將84只SPF級雄性Sprague-Dawley大鼠按隨機數(shù)字表法分為模型組（70只）和對照組（14只）。模型組大鼠采用硫代乙酰胺（TAA）注射法造模，對照組予等量0.9%氯化鈉注射液處理。采用超聲VTQ檢查大鼠肝臟剪切波速度（Vs），采用超聲微泡造影定量檢測到達時間（AT）、達峰時間（TTP）、峰值強度（PI）、平均通過時間（MTT）、AUC、肝動-靜脈渡越時間（HA-HVTT)。結(jié)果 大鼠肝纖維化程度與Vs呈正相關(guān)（r=0.887，P＜0.05），與 PI、AUC、HA-HVTT均呈負相關(guān)（r=-0.615、-0.782、-0.575，均 P＜0.05），即隨著肝纖維化程度的加重，出現(xiàn)Vs增加，PI降低，AUC減小，HA-HVTT縮短的趨勢。Vs診斷大鼠肝纖維化程度的靈敏度、特異度最高，AUC次之，HA-HVTT與PI相當。結(jié)論 VTQ和超聲微泡造影技術(shù)均可有效評估大鼠肝纖維化程度，其在人體的效果值得臨床研究。

肝纖維化 聲觸診組織量化技術(shù) 微泡 診斷 大鼠

肝纖維化是許多肝臟疾病尤其是各種慢性肝病常見和共同的病理轉(zhuǎn)歸。目前，臨床判斷肝纖維化程度的金標準是肝臟組織穿刺活檢，但其存在創(chuàng)傷大、不能動態(tài)觀察等諸多局限[1-2]。研究表明，肝實質(zhì)回聲的改變可作為反映肝纖維化程度的指標[3-5]，但其受患者主觀因素影響較大，且不能提供詳細量化信息。超聲的新技術(shù)-聲觸診組織量化技術(shù)（virtual touch tissue quantification，VTQ）結(jié)合超聲微泡造影技術(shù)憑借其安全、無輻射、無臨床禁忌，且可量化肝纖維化程度等諸多優(yōu)點，為肝纖維化的無創(chuàng)診斷研究提供了契機?；诖耍狙芯恐荚谔接慥TQ和超聲微泡造影技術(shù)對肝纖維化程度的評估價值，現(xiàn)報道如下。

1 材料和方法

1.1 實驗動物 84只SPF級雄性Sprague-Dawley大鼠，體質(zhì)量180～220g，由杭州赫貝科技有限公司提供（合格證編號：1401016），在 20～25℃燈光晝夜調(diào)控下自由進食、飲水。

1.2 動物模型制備 將大鼠按隨機數(shù)字表法分為模型組（70只）和對照組（14只）。模型組大鼠予以250mg/kg體質(zhì)量的劑量經(jīng)腹腔注射10%硫代乙酰胺（TAA）制備肝纖維化模型，2次/周，共10周。對照組大鼠予0.9%氯化鈉注射液同法同劑量處理。于給藥第 4、5、6、7、8、9、10周末，模型組大鼠每次取10只，對照組大鼠每次取2只，進行VTQ和超聲微泡造影檢查；后麻醉下行腹主動脈切開處死，解剖觀察并取肝組織行病理學檢查。

1.3 VTQ檢查

1.3.1 儀器 ACUSON S2000彩色多普勒超聲診斷儀（德國SIEMENS公司），探頭頻率8～11MHz，配有VTQ分析軟件，可進行VTQ檢測。

1.3.2 方法 固定大鼠，應用高頻探頭掃查，以肝右靜脈右側(cè)距肝包膜3mm處設(shè)定感興趣區(qū)（感興趣區(qū)大小固定），調(diào)取VTQ功能，激發(fā)獲取剪切波速度（Vs）并記錄，同一大鼠重復檢查5次取平均值。

1.4 超聲微泡造影檢查

1.4.1 儀器 ACUSON S2000彩色多普勒超聲診斷儀（德國SIEMENS公司），探頭頻率8～11MHz，對比劑為六氟化硫微泡（瑞士Bracco International B.V.公司）。

1.4.2 方法 25mg六氟化硫微泡予5ml 0.9%氯化鈉注射液稀釋后，取0.1ml經(jīng)靜脈團注并快速用0.9%氯化鈉注射液0.1ml沖管。全程超聲視頻錄像，脫機后用IMAGE ARENA分析軟件分析獲取肝臟血流灌注的時間強度曲線和數(shù)據(jù)，并記錄。本研究選取的定量分析相關(guān)參數(shù)包括：到達時間（arrive time，AT），達峰時間（time to peak，TTP），峰值強度（peak intensity，PI），平均通過時間（mean transit time，MTT），AUC，肝動-靜脈渡越時間（hepatic artry to hepatic vein transit time，HA-HVTT）。

1.5 病理學檢查 剪取大鼠肝左葉相同部位約10mm×10mm×10mm組織標本，采用4%甲醛溶液固定，常規(guī)石蠟包埋連續(xù)切片，HE、Masson及網(wǎng)狀纖維染色。肝纖維化病理診斷標準采用2015年全國《病毒性肝炎防治方案》中的慢性肝纖維化分期標準[6]。肝纖維化S0期為無肝纖維化；S1期為鏡下見肝細胞間質(zhì)纖維增生較多，肝細胞片狀壞死；S2期見肝細胞間質(zhì)明顯橋接纖維化，纖維間隔形成，尚不影響小葉結(jié)構(gòu)；S3期見肝組織間隙大量纖維間隔，肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂甚至破壞；S4期肝組織大量纖維增生，纖維間隔包繞形成假小葉，肝組織細胞廣泛壞死。

1.6 統(tǒng)計學處理 應用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件。計量資料以表示，采用Spearman相關(guān)分析肝纖維化程度與VTQ和超聲微泡造影定量參數(shù)的關(guān)系。以肝組織病理學檢查結(jié)果為金標準，應用ROC曲線分析VTQ和超聲微泡造影定量參數(shù)對大鼠肝纖維化程度的診斷效能。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組大鼠一般情況及病理學表現(xiàn)比較 模型組大鼠死亡14只，成模率為80.0%（56/70），對照組大鼠死亡1只。隨著給藥時間延長，模型組大鼠肝纖維化程度逐漸加重，其中S0期1只，S1期16只，S2期17只，S3期13只，S4期9只，病理學表現(xiàn)見圖1，而對照組大鼠均為S0期。

圖1 模型組大鼠肝組織病理學表現(xiàn)（a：第4周末，肝組織呈S0期纖維化表現(xiàn)；b：第5周末，肝組織呈S1期纖維化表現(xiàn)；c：第6周末，肝組織呈S2期纖維化表現(xiàn)；d：第8周末，肝組織呈S3期纖維化表現(xiàn)；e：第10周末，肝組織呈S4期纖維化表現(xiàn)；Masson染色，×40）

2.2大鼠肝纖維化程度與VTQ和超聲微泡造影定量參數(shù)的相關(guān)性分析 不同肝纖維化程度大鼠Vs、PI、AUC、HA-HVTT比較見表1。

由表1可見，大鼠肝纖維化程度與Vs呈正相關(guān)（r=0.887，P＜0.05），與 PI、AUC、HA-HVTT 均呈負相關(guān)（r=-0.615、-0.782、-0.575，均 P＜0.05），即隨著肝纖維化程度的加重，出現(xiàn)Vs增加，PI降低，AUC減小，HAHVTT縮短的趨勢。

表1 不同肝纖維化程度大鼠Vs、PI、AUC、HA-HVTT比較

2.3 Vs、PI、AUC、HA-HVTT診斷大鼠肝纖維化程度的 效能比較 見圖2、表2。

圖2 Vs、PI、AUC、HA-HVTT診斷大鼠肝纖維化程度的ROC曲線（a：肝纖維化S≥2期；b：肝纖維化S≥3期；c：肝纖維化S4期）

表2 Vs、PI、AUC、HA-HVTT診斷大鼠肝纖維化程度的效能比較

由圖2、表2可見，Vs診斷大鼠肝纖維化程度的靈敏度、特異度最高，AUC次之，HA-HVTT與PI相當。

3 討論

肝纖維化的形成和發(fā)展是一個動態(tài)的病理學過程[7]。有效的病因治療可以逆轉(zhuǎn)肝纖維化。因此，早期和量化診斷肝纖維化程度對于及時干預治療并逆轉(zhuǎn)肝纖維化的發(fā)展具有十分重要的臨床價值[8]。超聲評價肝纖維化是目前臨床無創(chuàng)診斷肝纖維化研究的熱點之一[9]。常規(guī)的超聲檢查對已有形態(tài)學改變的病態(tài)肝有一定的診斷價值，但其診斷早期肝纖維化或肝硬化的靈敏度不高。超聲檢查受操作者主觀判斷和經(jīng)驗的影響，且更多的依賴設(shè)備。這些都是傳統(tǒng)超聲檢查的局限性。

近年來，超聲彈性成像成為肝纖維化無創(chuàng)診斷研究的熱點[10]，VTQ技術(shù)是彈性成像的一種，可定量描述“觸診”效果[11]。其原理是聲脈沖輻射力成像和剪切波傳播，將感興趣區(qū)組織的Vs精確快速地計算出來，在診斷過程中不需要檢查者手動施壓，不受外部壓力影響，而是由探頭發(fā)射恒定壓力的脈沖波引起，避免了因主觀因素產(chǎn)生的干擾。對傳統(tǒng)超聲成像結(jié)果有一定價值的補充作用。VTQ在評估肝纖維化程度方面的研究在西方國家是以慢性丙型肝炎為主要研究對象，并取得了一些成果[12]。本研究以肝纖維化大鼠為研究對象，發(fā)現(xiàn)隨著肝纖維化程度的加重，Vs呈增加趨勢。應用ROC曲線評估Vs診斷效能，發(fā)現(xiàn)Vs診斷大鼠肝纖維化程度的靈敏度、特異度很高。

超聲微泡造影是一種典型的血池示蹤成像技術(shù)。對比劑微泡直徑約為2～4 μm，血流動力學與紅細胞幾乎完全一致，經(jīng)靜脈注射微泡后，可順利通過肺循環(huán)到達全身血管系統(tǒng)，并持續(xù)足夠長的時間，不但能夠提高低速血流的檢出能力，而且能夠作為良好的血池示蹤劑反映肝臟的血流灌注狀態(tài)。有研究表明，肝臟血流動力學改變的發(fā)生遠早于肝臟形態(tài)學改變，隨著肝纖維化程度加重，會出現(xiàn)肝內(nèi)血流動脈化、肝臟血管分支存在異常吻合、肝動靜脈瘺等[13]。應用超聲造影時間強度曲線分析系統(tǒng)可以獲得肝內(nèi)動脈、門脈和微循環(huán)的血流灌注量化信息，對肝纖維化程度進行有效評估[14-16]。本研究發(fā)現(xiàn)隨著大鼠肝纖維化的加重，由于纖維組織增生，肝毛細血管阻力增高，致使PI降低、AUC減小、HA-HVTT縮短，這種趨勢也越來越明顯。應用ROC曲線評估各指標診斷效能，發(fā)現(xiàn)AUC對不同分級的肝纖維化鑒別能力較好，而HA-HVTT與PI的診斷價值相當。

本研究的不足之處在于，作為動物實驗，大鼠肝臟的解剖結(jié)構(gòu)和生理病理狀態(tài)下的功能改變與人體存在一定的差別，其檢測結(jié)果與人體也可能存在不同。本研究采用的是高頻線陣探頭，而臨床患者檢查一般采用低頻凸陣探頭，是否會造成檢測結(jié)果的差異尚需進一步研究證實；再者，有研究顯示肝細胞炎癥程度、肝功能異常、膽汁淤積等都會增加Vs[17]，尚需深入探討它們對彈性檢測值的影響；本研究所及參數(shù)對肝纖維化程度的診斷效能還需在有病理學檢查對照的人群中進一步驗證。

綜上所述，本研究結(jié)果顯示，Vs、AUC、HA-HVTT、PI均可以有效地評估肝纖維化程度。VTQ和超聲微泡造影技術(shù)作為超聲無創(chuàng)診斷肝纖維化程度的方法，值得臨床進一步研究。

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本刊編輯部

Assessement of hepatic fibrosis by virtual tough tissues quantification and ultrasound microbubbles in rats

LIU Fang,HUANG Bin.
Department of Ultrasonography,Hangzhou Xixi Hospital,Hangzhou 310023,China

Objective To apply virtual tough tissues quantification(VTQ)and ultrasound microbubbles techniques in evaluation of hepatic fibrosis in rats. Methods Eighty four SPF male Sprague-Dawley rats were randomly divided into model group(n=70)and control group(n=14).Liver fibrosis was induced by injection of thioacetamide(TAA)in model group,while equal volume of normal saline was injected in control group.The liver shear wave velocity(Vs)was examined with VTQ,the time to peak(TTP),peak intensity(PI),mean transit time(MTT),AUC and hepatic artery to hepatic vein transit time(HA-HVTT)were determined with ultrasonic microbubbles. Results The degree of liver fibrosis in rats was positively correlated with Vs(r=0.887,P＜0.05),negatively correlated with PI,AUC and HA-HVTT(r=-0.615,-0.782 and-0.575,all P＜0.05).With the increase of hepatic fibrosis degree,Vs increased and Pi,AUC,HA-HVTT decreased.The sensitivity and specificity of Vs in diagnosis of liver fibrosis degree in rats were the highest,followed by AUC time,while those of HA-HVTTis and PI were similar. Conclusion VTQ and ultrasound microbubbles might be used in evaluating stages of liver fibrosis clinically and further studies should be conducted.

Liver fibrosis Virtual tough tissues quantification Microbubble Diagnosis Rats

10.12056/j.issn.1006-2785.2017.39.24.2017-1908

浙江省自然科學基金資助項目（LY13H180015）作者單位：310023 杭州市西溪醫(yī)院特檢科

黃斌，E-mail：HB2K@163.com

2017-08-09）

李媚）