表兒茶素沒食子酸酯抑菌活性的研究①

陳星卉

(哈爾濱商業(yè)大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150028)

表兒茶素沒食子酸酯抑菌活性的研究①

陳星卉

(哈爾濱商業(yè)大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150028)

目的：探討表兒茶素沒食子酸酯抑菌活性。方法：本研究通過二倍稀釋法測量最小抑菌圈從而確定ECG對6種致病菌的最小抑菌濃度(MIC)。采用結(jié)晶紫實驗對表兒茶素沒食子酸酯作用前后細(xì)菌細(xì)胞膜完整性的變化進行測定。結(jié)果：表兒茶素沒食子酸酯對大腸桿菌、腸炎沙門氏菌、變異鏈球菌、綠膿桿菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌的MIC值0.125mg/mL;結(jié)晶紫實驗中，隨著ECG濃度的增大，OD590也隨之增大。結(jié)論：實驗證明ECG的滅菌機制是對其細(xì)菌細(xì)胞膜通透性進行改變，并破壞細(xì)胞膜的完整性，使細(xì)胞外的小分子容易進入以及引起細(xì)胞內(nèi)的小分子物質(zhì)泄漏。

表兒茶素沒食子酸酯；抑菌活性；最小抑菌濃度；致病菌

表兒茶素沒食子酸酯(簡稱ECG)是從綠茶中分離得到的一種具有廣譜抗菌作用的活性物質(zhì)。本研究擬進一步探索ECG對綠膿桿菌(Pseudomonas aeruginosa)、腸炎沙門氏菌(Salmonella enteritidis)、大腸桿菌(Escherichia coli)、變異鏈球菌(Streptococcus mutans)、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、金黃色葡萄球菌(Staphyloccocus aureus)等常見致病菌是否存在抗菌作用，從而研究 ECG對上述6種致病菌抗菌活性及抗菌機制。

1 資料與方法

1.1 一般資料

隨著廣譜抗菌藥物使用頻繁，致使很多細(xì)菌產(chǎn)生了耐藥性。為了降低細(xì)菌耐藥性產(chǎn)生，我們應(yīng)該合理的使用抗菌藥物。因此在天然藥物中對新型抗菌活性成分的研發(fā)，可以緩解耐藥性的問題。表兒茶素沒食子酸酯是從綠茶中提取的活性物質(zhì)，是茶多酚的主要成分之一，其含量約為24%[1]。具有抗癌、抗突變、防治心腦血管系統(tǒng)疾病以及調(diào)理內(nèi)分泌、提高機體免疫力等生物活性[2～4]，同時也可以抑制機體內(nèi)生物代謝酶從而抑制新陳代謝作用。早些年，國內(nèi)外學(xué)者對茶葉及其茶多酚的藥理活性的研究進展進行過系統(tǒng)分析[5～6]。發(fā)現(xiàn)其具有高效低毒的抗腫瘤[7]、抗氧化、抗菌、治療心血管疾病等的潛能[8]。蔡軼等[9]研究了表兒茶素沒食子酸酯對對人鼻咽癌C666 -1細(xì)胞凋亡的影響，初步證實了表兒茶素沒食子酸酯人鼻咽癌C666 -1細(xì)胞[10]具有顯著的增殖抑制作用。焦嬋媛[11]等對表兒茶素及其衍生物表兒茶素沒食子酸酯抑制前列腺間質(zhì)細(xì)胞增值,得出ECG抑制前列腺間質(zhì)細(xì)胞增殖的作用機制是通過ERK44/42進行的。表兒茶素沒食子酸酯也可以與傳統(tǒng)廣譜抗菌藥物協(xié)同作用從而提高其抑菌效果，華德興[12]等人對表兒茶素沒食子酸酯與四環(huán)素進行協(xié)同實驗，研究其抗金黃色葡萄球菌作用及機制從而得出ECG與抗生素類藥物的協(xié)同抗菌效果會增強。

1.2 方法

1.2.1表兒茶素沒食子酸酯對致病菌MIC的測定

參照瓊脂稀釋法測定致病菌的MIC[13]，將試驗方法改進，配制八種不同濃度的ECG。

在超凈工作臺中進行操作，準(zhǔn)備直徑0.75cm的濾紙片48個；采用二倍稀釋法配制八種濃度不同的ECG溶液；準(zhǔn)備六個固體培養(yǎng)基，每個固體培養(yǎng)基平皿背面做好標(biāo)記1.2.3.4.5.6.7.8；取濾紙片浸入2mg/mLECG溶液中放在平皿“1”位置，取第二張濾紙片浸入1mg/mLECG溶液中放在平皿“2”位置，按上述步驟依次放置浸泡過藥品溶液的濾紙片在固定位置，每個平皿放八個不同濃度藥品溶液的濾紙片；放入37℃恒溫培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)；測量抑菌圈的直徑，最小直徑的抑菌圈所對應(yīng)的藥品濃度即為該致病菌的MIC值，具體濃度配置可見表1。

表1 ECG溶液的配制

1.2.2 致病菌細(xì)胞的完整性變化觀察

行離心操作，8000r/min下離心棄上清液；加入0.5%NaCl溶液200μL進行洗滌再重懸；取致病菌懸液200μL取6個離心管，標(biāo)號，分別均勻的加入已經(jīng)接種過致病菌的營養(yǎng)肉湯液體培養(yǎng)液40mL；進分裝在規(guī)格1mL的離心管中分別加入不同濃度藥物(MIC作為最大濃度，依次2倍稀釋：2MIC，MIC，0.5MIC、0.5%NaCl)200μL；將離心管放入恒溫培養(yǎng)箱中37℃孵育8h；孵育完成后，進行離心取菌，加入200μL 的0.5%NaCl洗滌重懸；將1 mg/mL結(jié)晶紫溶液200μL加到各個離心管中，混勻后將離心管都放到恒溫培養(yǎng)箱中37℃孵育10min；孵育完成后，再進行離心操作，取上清液進行UV 590nm下測吸光度。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 表兒茶素沒食子酸酯MIC的測定結(jié)果

按最小抑菌濃度測定操作方法操作，測量六種致病菌的固體培養(yǎng)基上8個不同濃度濾紙片所產(chǎn)生的抑菌圈直徑大小比較，直徑。所以表兒茶素沒食子酸酯對大腸桿菌、腸炎沙門氏菌、變異鏈球菌、綠膿桿菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌的MIC值0.125mg/mL。抑菌圈直徑單位(cm)。見表2。

表2 MIC的測定結(jié)果

注：-代表沒有抑菌圈

2.2 結(jié)晶紫實驗結(jié)果

將六組致病菌的1～4號離心管按結(jié)晶紫測定操作方法，測定各個離心管內(nèi)上清液590nm下的UV吸光度。大腸桿菌、腸炎沙門氏菌、變異鏈球菌、綠膿桿菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌六組致病菌的1～4號離心管內(nèi)藥物濃度依次為0.250mg/mL、0.125mg/mL、0.063mg/mL、0mg/mL。根據(jù)實驗結(jié)果，見表3。

表3 致病菌細(xì)胞膜完整性測定

根據(jù)上表2～3可知，隨著ECG濃度的增加，OD590也增加，說明ECG對致病菌細(xì)胞膜能造成破壞，并且隨著藥物ECG濃度的逐漸增大，致病菌細(xì)胞膜被造成的破壞更為嚴(yán)重(P<0.05)。見圖1。

圖1 ECG對于6種致病菌的OD590測定

3 討論

本實驗主要針對致病菌的細(xì)胞膜通透性作用，但是未完全考慮到ECG是否對大腸桿菌、綠膿桿菌等細(xì)菌的DNA、細(xì)胞壁或其它部位有無影響，若是條件允許，對其它部位也進行相關(guān)測定是有必要的。

[1]王倩如. 毛細(xì)管電色譜的研究進展及其在藥物分析中的應(yīng)用[J]. 黑龍江醫(yī)藥科學(xué), 2010, 33(5): 26-27

[2]毛小強, 那萬里, 趙丹, 等. 茶多酚對前列腺癌 PC-3M細(xì)胞增殖與凋亡的影響[J]. 中國實驗診斷學(xué), 2010, 14(2):170-173

[3]李麗, 唐燕霞, 黃志明, 等. 表沒食子兒茶素沒食子酸酯對柔紅霉素致小鼠心臟毒性的預(yù)防作用[J]. 醫(yī)藥導(dǎo)報, 2014, (7):841-844

[4]陳悅, 劉秋慧. 茶多酚對豚鼠心肌細(xì)胞鈣電流及動作電位的影響[J]. 中國藥學(xué)雜志, 2010，45(3): 190-192

[5]Lung H L, Man O Y, Yeung M C, et al. SAA1 polymor-phisms are associated with variation in antiangiogenic andtumor-suppressive activities in nasopharyngeal carcinoma[J]. Oncogene, 2015, 34(7):887-889

[6]Fang C Y, Wu C C, Hsu H Y, et al. EGCG inhibits pro-liferation, invasiveness and tumor growth by up-regulation of adhesion molecules, suppression of gelatinases activi-ty, and induction of apoptosis in nasopharyngeal carcino-ma cells[J]. International Journal of Molecular Sciences, 2015, 16(2): 2530-2558

[7]高君,王志華. 腫瘤生物治療的研究近況[J]. 黑龍江醫(yī)藥科學(xué), 2007, 30(1):48-50

[8]朱松. 表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)酶法乙酰化分子修飾及其產(chǎn)物的抗氧化性能研究[D]. 無錫: 江南大學(xué), 2014:37-51

[9]蔡軼, 魏沁, 蔡躍, 等. 表兒茶素沒食子酸酯對人鼻咽癌C666-1細(xì)胞凋亡的影響[J]. 華南師范大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版), 2015, (4):103-107

[10]唐惠玲. NF-κB信號傳導(dǎo)與疾病研究進展[J]. 黑龍江醫(yī)藥科學(xué),2012,35(5):34-36

[11]焦嬋媛, 景春暉, 員小婷, 等. 表兒茶素及其衍生物表兒茶素沒食子酸酯通過MAPK-ERK44/42通路抑制前列腺間質(zhì)細(xì)胞增殖[J]. 天津中醫(yī)藥, 2017, (3):200-203

[12]華德興, 許曉玲, 彭青, 等. 表兒茶素沒食子酸酯與四環(huán)素協(xié)同抗金黃色葡萄球菌作用及機制[J]. 中國新藥與臨床雜志, 2009, (12):935-939

[13]李艷捧, 段昕所, 陸潔, 等. 瓊脂稀釋法檢測6種藥物抗皮膚癬菌MIC[J]. 中國麻風(fēng)皮膚病雜志, 2004, (4):369-372

[14]陳兵,賀娟,張春斌. 氧化應(yīng)激的原理及作用[J]. 黑龍江醫(yī)藥科學(xué), 2014, 37(6):2-3

[15]呂冬霞,王曉麗,魏鳳香,等. 玉米須多糖誘導(dǎo)人肝癌SMMC-7721細(xì)胞凋亡的研究[J]. 黑龍江醫(yī)藥科學(xué),2006,29(4):28-29

陳星卉(1995～)女 ，黑龍江佳木斯人，學(xué)士。

R978.1

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1008-0104(2017)06-0129-02

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