吡唑鋅配合物的合成、晶體結構及抗肝癌細胞活性

李 婧 吳春陽 張 瑩 申貴男 金成浩

(黑龍江八一農墾大學生命科學技術學院，大慶 163319)

吡唑鋅配合物的合成、晶體結構及抗肝癌細胞活性

李 婧＊吳春陽 張 瑩 申貴男 金成浩

(黑龍江八一農墾大學生命科學技術學院，大慶 163319)

通過溶劑揮發法合成了鋅配合物 [Zn(Hppo)2(ppo)Cl](1)，Hppo=5-苯基-3-羥基吡唑，利用元素分析、FTIR以及X射線衍射法對配合物1進行表征。晶體結構顯示配合物屬于單斜晶系，P21空間群。檢測了配合物1對肝癌細胞HepG2、Hep3B和Huh7的細胞形態與細胞毒性的影響，結果表明配合物1對腫瘤細胞具有明顯的抑制作用。

吡唑；抗腫瘤活性；金屬配合物；晶體結構

0 引 言

吡唑啉酮化合物具有多種生物活性，例如消炎、抗菌、抗腫瘤等，在醫藥、農藥等方面得到廣泛的應用[1-6]，原因在于其具有多種配位形式，可以與多種金屬形成結構各異的配合物。研究發現吡唑類金屬配合物常表現出較吡唑配體更強的生物活性[6-7]，其抗腫瘤作用使其成為抗腫瘤新藥開發領域的熱點[3-13]。例如Caruso等[10]報道了吡唑啉酮-5氧鈦配合物，對乳腺癌細胞TA-3有較強的抑制作用，IC50為 90 μmol·L-1。 Budzisz等[11]合成 Pt和 Pd 的吡唑配合物，對人早幼粒白血病HL-60細胞和淋巴白血病NALM-6細胞均有較強的抑制作用，IC50均小于10 μmol·L-1。稀土金屬在與吡唑啉酮形成配合物后也表現出抗腫瘤活性，何其莊等[12]報道的Gd配合物對人白血病K562細胞有明顯的體外增值抑制作用(IC50=7.5 μmol·L-1)。吡唑啉酮金屬配合物的開發和其抗腫瘤活性作用研究具有重要價值[14]。

鋅是生物體內必需的微量元素，參與多種新陳代謝。在對非鉑類抗癌藥物的研究中，鋅配合物的研究還較少[14-19]。 Zhang等[18]以 1-(3-(2-吡啶基)吡唑-1-基甲基)萘為配體合成吡唑類鋅配合物，該配合物能有效的結合DNA，并且具有抑制癌細胞增值的作用。仇曉陽等[19]報道肼基二硫代甲酸芐酯席夫堿的鋅配合物對腫瘤細胞MKN45有弱抑制性。Kovala-Demertzi等[20]合成了一組鋅與胺苯硫脲類配合物，表現出具有和順鉑相當的抗腫瘤活性。Stanojkovic等[21]合成的4-氟苯基哌嗪鋅的配合物對腫瘤增值效果強于順鉑，IC50值在 26～90 nmol·L-1。 Lopes等[22]以吡啶基縮氨基硫脲化合物為配體與鋅形成配合物，體內抗腫瘤研究表明，配合物對MDA-MB-231和HepG2細胞具有較強的腫瘤抑制作用。鋅類配合物的抗腫瘤活性研究具有重要的研究意義。

5-苯基-3-羥基吡唑(Hppo)結構當中含有2個N原子，一個氧原子，具有多種配位形式，其合成簡單。以此化合物為配體，形成金屬配合物并研究磁學性質早有報道[23]，但未見抗腫瘤活性研究。本文以Hppo為配體與ZnCl2反應，得到單核配合物[Zn(Hppo)2(ppo)Cl](1)，并初步用體外實驗研究配合物對人肝癌細胞HepG2、Hep3B和Huh7的抑制作用，金屬配合物表現出明顯的腫瘤抑制活性。

1 實驗部分

1.1 實驗儀器、試劑與藥品

元素分析在Perkin-Elmer 240C元素分析儀上測定。晶體結構在Bruker Smart APEX CCDⅡ衍射儀上完成。紅外光譜使用Nicolet 380型紅外光譜儀由KBr壓片法測定。酶標儀使用Bio-Tek公司酶標儀。

試劑和藥品：DMEM高糖(美國Hyclone公司)；胎牛血清(Solarbio公司)；胰蛋白酶(Solarbio公司)；青鏈霉素(Solarbio公司)；5-氟尿嘧啶(Macklin公司)；臺盼藍(Sigma 公司)；PBS 粉末(Biosharp 公司)；MTT(二甲基溴化四氮唑藍，Macklin公司)；人肝癌細胞(HepG2，Hep3B，Huh7)取自美國模式培養物集存庫(ATCC)。其他試劑均為分析純。配體Hppo由水合肼和苯乙酰乙酸乙酯通過文獻方法制備[23]。

1.2 配合物[Zn(Hppo)2(ppo)Cl](1)的合成

在圓底燒瓶中加入無水ZnCl2(0.068 g,0.5 mmol)，無水乙醇(6 mL)，在64℃下攪拌直至全部溶解。隨后加入5-苯基-3-羥基吡唑(Hppo)[24](0.080 g，0.55 mmol)，攪拌回流1 h，過濾，濾液靜置于無震動的平臺，用保鮮膜將燒杯封口，并在保鮮膜上扎若干小孔，1周后有白色塊狀晶體產物，產量0.028 g，產率26%。元素分析按C27H23ClN6O3Zn計算，實測值(%，括號內為計算值)C 55.23(55.88)，H 4.10(3.99)，N 14.32(14.48)。IR(KBr，cm-1)：3 422m，3 339m，3 145m，1 618m，1 567m，1 535s，1 501s，756s，696m，548m。

1.3 晶體結構測定

取適宜大小的配合物1的單晶，用(Bruker Smart APEX CCDⅡ)衍射儀在173(2)K條件下收集衍射數據(SMART程序)。衍射光源經石墨單色化的Mo Kα 射線 (λ=0.071 073 nm)， 掃描方式為 φ-ω scan。收集到的衍射數據用SAINT程序還原后再用SADABS程序作吸收校正。結構用SHELXS-97程序由直接法解出[25]，并用SHELXL-97程序[25]對非氫原子坐標及其各向異性溫度因子進行全矩陣最小二乘法精修至收斂；氫原子坐標由理論計算確定。有關晶體學數據如表1所示，主要鍵長鍵角如表2所示。

CCDC：1561437。

表1 配合物1的晶體學數據Table1 Crystallographic data of complex 1

表2 配合物1主要的鍵長(nm)和鍵角(°)Table2 Selected bond lengths(nm)and bond angles(°)of complex 1

1.4 細胞培養

將人肝癌細胞(HepG2、Hep3B、Huh7)置于含有體積分數10%胎牛血清、1%青鏈霉素的DMEM高糖培養基中，在37℃、5%CO2(V/V，下同)條件下培養至第三代對數生長期。

1.5 配合物1的體外抗癌活性測試

1.5.1 對細胞形態的影響

選擇對數生長期并且狀態良好的HepG2、Hep3B和Huh7細胞分別接種于96孔板，濃度為2×104mL-1，每孔 200 μL。 于 5%CO2，37 ℃培養箱中培養8 h后，細胞貼壁并恢復生長狀態后，棄去培養液，并加入1%FBS培養液200 μL。配合物 1用DMSO 溶劑溶解， 稀釋至 125.00、62.5、15.63、3.91 μg·mL-1四個加藥終濃度，并分別取 1 μL加入到細胞中。在5%CO2，37℃培養箱中培養48 h后，于倒置顯微鏡下觀察細胞形態的變化。

1.5.2 MTT法檢測細胞毒性

分別取對數生長期HepG2、Hep3B和Huh7細胞接種于96孔板上，濃度為5×104mL-1，每孔液體為200 μL，即每孔細胞數約為1×104個。將96孔培養板置于5%CO2，37℃培養箱中培養8 h至細胞完全貼壁后，棄去培養液并在每孔加入1%FBS培養液200 μL，饑餓處理2 h。用DMSO將配合物1稀釋至濃度 為 250.00、125.00、62.5、31.25、15.63、7.82 μg·mL-1， 實驗組每孔滴加藥物 1 μL； 藥物 ZnCl2、Hppo和陽性對照藥物5-氟尿嘧啶(5-FU)，每孔滴加1 μL，濃度為 250.00、125.00、62.50、31.25 μg·mL-1(DMSO溶劑)。DMSO最終濃度小于1%，基本不影響細胞活性。另設陰性對照組和溶劑對照組(DMSO)。將加入配合物1的96孔培養板置于5%CO2，37℃培養箱中分別培養 24、48、72 h， 而將加入 ZnCl2、Hppo和5-氟尿嘧啶的96孔培養板培養48 h。離心，棄去上層培養基，各孔加入90 μL不含血清的DMEM培養基與10 μL濃度為5 mg·mL-1的MTT，置于37℃、5%CO2條件下再繼續培養4 h。移去上清液，每孔加入 DMSO 150 μL，振蕩 5 min，利用酶標儀于490 nm處測定各孔吸光度值，計算細胞存活率，繪制成細胞存活率曲線圖，用SPSS計算細胞毒性IC50值。

2 結果與討論

2.1 配合物[Zn(Hppo)2(ppo)Cl](1)的合成與紅外光譜解析

無水ZnCl2與Hppo反應要在加熱的條件下反應，溫度低會導致ZnCl2析出，影響產率。反應結束后趁熱過濾，靜置1周左右，即得無色透明塊狀晶體。晶體產率偏低，溶劑揮發時間增長，會使產率增加，但是晶體多為碎晶。配合物的紅外譜圖顯示，在3 422 cm-1為OH吸收峰，3 339 cm-1為NH吸收峰，在 1 618、1 567、1 501 cm-1，出現苯環及吡唑環ν(C=C)雙鍵吸收峰，1 535 cm-1為 ν(C=N)吸收峰，756、696 cm-1，為單取代苯環 ν(C-H)吸收峰，548 cm-1處出現Zn-N鍵吸收峰。

2.2 晶體結構描述及表征

圖1為配合物1的晶體結構，其主要鍵長、鍵角列于表2，其分子內和分子間氫鍵列于表3。該分子為單核配合物，鋅原子為四配位，與3個吡唑環上N原子和1個Cl原子配位形成一個扭曲的四面體構型。其中Zn-N的鍵長分別為0.201 4(7)、0.198 2(7)和0.197 7(7)nm，Zn-Cl的鍵長較長，為0.226 2(2)nm；鋅與配位原子的鍵角從105.6(3)°到113.9(2)°。

晶體結構解析表明，N1與鋅原子鍵合，在此種情況下，吡唑環與鋅原子可形成3種鍵合方式，如圖2所示：方式Ⅰ中，N1的孤對電子與Zn配位；方式Ⅱ、Ⅲ中，N1失去質子與Zn形成離子鍵。紅外數據中未見C=O吸收峰，說明配合物中不含有方式Ⅲ；1 535 cm-1處的 ν(C=N)吸收峰，較通常 ν(C=N)鍵(1 690～1 590 cm-1)向短波方向移動，說明N原子參與配位，因此方式Ⅰ為配合物中吡唑結構。3個吡唑配體在與鋅形成配合物時，需要失去1個質子達到電荷平衡，羥基氫較氨基氫活潑，因此其中一個羥基失去質子形成負離子。由于3個吡唑環的電子分布情況非常接近，在確定羥基氧負離子時，通過比較連有羥基的C-O鍵長,C(3)-O(1)為0.134 8(10)nm;C(12)-O(2)為 0.131 6(10)nm；C(21)-O(3)為 0.130 6(10)nm；C(21)-O(3)鍵長較短，因此把 O(3)確定為去質子，進而得出圖1中晶體結構。

在該晶體中，配合物通過3個分子內氫鍵N(2)-H(2)與 O(3)、N(4)-H(4)與 O(1)、N(6)-H(5)與 O(2)使 3個吡唑配體形成環狀構型。分子間是通過O(1)-H(1)與另一分子的 Cl(1)i(Symmetry codes：i1+x，y，z)形成分子間氫鍵，進而構成一維鏈狀，鏈與鏈之間通過分子上的O(2)-H(3)和另一鏈上的O(3)ii(Symmetry codes：ii1-x，1/2+y，1-z)形成分子間氫鍵，使配合物形成三維網狀結構(圖3)。

表3 配合物1的分子內和分子間氫鍵參數Table3 Intramolecular and intermolecular hydrogen bond parameters of complex 1

圖1 配合物1的晶體結構(橢球率30%)Fig.1 Molecular structure of the complex 1 with 30%probability ellipsoids

圖2 吡唑與鋅的3種鍵合形式Fig.2 Three binding types of pyrazole and Zn

2.3 配合物1對HepG2、Hep3B和Huh7細胞形態的影響

圖4顯示為在配合物1作用48 h后，肝癌細胞HepG2、Hep3B和Huh7的細胞形態。通過倒置顯微鏡觀察可見，空白對照組細胞大小均一，胞質顏色透明。隨著藥物濃度的增加和作用時間的延長，細胞輪廓增強，細胞變圓浮起反差增大，細胞間接觸變松，增殖減慢，胞質中顆粒增多。同時，死細胞的數量增多，有的細胞內可見有明顯空泡，細胞完整性受到破壞，形成大量細胞碎片。

圖4 配合物1作用48 h后，倒置顯微鏡下肝癌細胞HepG2、Hep3B、Huh7的細胞形態(×200)Fig.4 Effect of complex 1 on tumor cell morphology of HepG2,Hep3B,Huh7 cell lines after 48 h investigated by inverted phase-contrast microscopy(×200)

2.4 配合物1對HepG2、Hep3B和Huh7的細胞毒性

實驗采用 MTT法檢測金屬配合物 1、ZnCl2、Hppo和5-FU對HepG2、Hep3B和Huh7的細胞毒性。在加藥24、48、72 h后，不同藥物對肝癌細胞HepG2、Hep3B和Huh7造成了不同程度的抑制作用。配合物1具有較強的抑制效果，圖5顯示了配合物1對HepG2、Hep3B和 Huh7細胞， 在 24、48、72 h的抑制情況。表4總結了藥品的IC50，其中對Hep3B抑制效果最好，48 h時的IC50值為9.88 μg·mL-1， 對 HepG2 細胞的 IC50值為 20.73 μg·mL-1，對Huh7 細胞的抑制作用最弱，IC50值為 52.16 μg·mL-1。金屬配合物1對肝癌細胞的抑制均呈劑量依賴，即隨藥物濃度的增加細胞的抑制效果增強。在給藥時間為24～48 h時，抑制率隨著作用時間的增強而增強，呈正相關。

圖5 配合物1對腫瘤細胞HepG2、Hep3B和Huh7的抑制率曲線(n=3)Fig.5 Inhibition rate of complex 1 against tumor cell lines HepG2,Hep3B and Huh7(n=3)with the increasing of concentration

通過對比配合物 1與 ZnCl2、Hppo和5-FU對HepG2、Hep3B和Huh7的抑制作用發現(圖6)，在樣品濃度62.50 μg·mL-1下，吡唑配體和金屬鹽對細胞抑制效果較弱，金屬配合物1對Hep3B和HepG2抑制效果與5-氟尿嘧啶的抑制效果相當，對Hep3B細胞的作用效果甚至強于陽性對照藥，對Huh7的抑制效果較弱，與上面實驗相符。在已報道的吡唑類金屬配合物的抗腫瘤作用機制研究中，吡唑配體多數以非共價鍵結合方式與DNA相互作用[14]。配合物1中含有苯環和吡唑環，可以通過插入方式嵌入DNA，這有可能是配合物的抗腫瘤活性原因之一。

表4 配合物1對Hep3B、HepG2和Huh7細胞的IC50值(n=3)Table4 IC50of complex 1 on tumor cell Hep3B,HepG2 and Huh7(n=3)μg·mL-1

圖6 化合物對細胞Hep3B、HepG2和Huh7的抑制率(n=3)Fig.6 Inhibition rate of the compounds against HepG2,Hep3B and Huh7(n=3)

3 結 論

合成了新型金屬配合物[Zn(Hppo)2(ppo)Cl]并表征了其晶體結構。Znギ為四面體配位，配體5-苯基-3-羥基吡唑(Hppo)通過吡唑環上的N原子與Zn配位，分子上的OH和NH通過形成分子內和分子間氫鍵穩定配合物結構。體外細胞實驗顯示配合物1對肝癌細胞HepG2，Hep3B和Huh7具有增值抑制作用，其中對Hep3B的抑制效果最好，強于陽性對照5-氟尿嘧啶。ZnCl2與Hppo對3種肝癌細胞的抑制效果較弱，在形成配合物后生物活性增強。

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Synthesis,Crystal Structure and Antitumor Activity of Pyrazole Zinc Complex

LI Jing＊WU Chun-Yang ZHANG Ying SHEN Gui-Nan JIN Cheng-Hao
(College of Life Science and Biotechnology,Heilongjiang Bayi Agriculture University,Daqing,Heilongjiang 163319,China)

A zinc complex[Zn(Hppo)2(ppo)Cl](1)(Hppo=3-benzyl-3-pyrazolin-5-one)was synthesized by solvent evaporation and characterized by elemental analysis,FTIR and X-ray diffraction.The complex crystallizes in monoclinic system,space group P21.Cell morphology and in vitro toxicity effects against cancer cell lines HepG2,Hep3B and Huh7 of the complex were investigated.The bioassay results show that this zinc complex has distinct antitumor effects.CCDC:1561437.

pyrazole;antitumor activity;metal complex;crystal structure

O614.24+1

A

1001-4861(2018)01-0135-07

10.11862/CJIC.2018.016

2017-03-30。收修改稿日期：2017-11-10。

國家自然科學基金(No.31400660)、黑龍江八一農墾大學青年創新人才基金(No.CXRC2016-13)和黑龍江省自然科學基金(No.QC2016012)資助項目。

＊通信聯系人。 E-mail：lijingroea@sina.com