豬組織中賽庚啶間接競爭ELISA檢測方法研究

楊玉婷+秦譽

酶聯免疫分析方法（Enzyme-Linked Immuno-So rbent Assay， ELISA）具有特異性高、靈敏度高和成本低等特點，適用于現場監控和大量樣本的快速篩選。本研究在前期制備的賽庚啶人工抗原和單克隆抗體基礎上，建立了對豬組織中賽庚啶殘留的間接競爭ELISA檢測方法，為后續檢測產品研發奠定了基礎。

賽庚啶（Cyproheptadine，CLD）是一種具有抗膽堿能力和鎮靜作用，可用于治療各種過敏性疾病的抗組胺藥，也可用于改善患者食欲。近年來，人們發現在飼料產品中添加賽庚啶會增加動物食欲，可達到增加養殖動物體重的目的。但食用含賽庚啶殘留的動物源性產品會對人體造成不利影響，濃度高時可直接引發昏厥、呼吸急促、全身無力等中毒癥狀，嚴重者則直接導致死亡。

農業部1519號公告將賽庚啶列入《禁止在飼料和動物飲水中使用的物質》，然而飼料安全預警監測結果表明，國內仍然有一些飼料產品中添加了此類藥物，同時也有在豬肉組織中檢出賽庚啶殘留的報道。因此，加強對賽庚啶殘留的檢測迫在眉睫。目前，已報道的檢測方法有液相色譜法、液相色譜-串聯質譜法，而且多為動物尿液及飼料中賽庚啶殘留的檢測。因此，建立一種直接、方便、靈敏、高效、準確的檢測方法十分必要。酶聯免疫分析方法具有特異性高、靈敏度高和成本低等特點，適用于現場監控和大量樣本的快速篩選。本研究在前期制備的賽庚啶人工抗原和單克隆抗體基礎上，建立了對豬組織中賽庚啶殘留的間接競爭ELISA檢測方法，為后續檢測產品研發奠定了基礎。

材料與方法

材料與試劑

賽庚啶和可樂定標準品（98%中國獸醫藥品監察所）、辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠IgG（美國Jackson）、四甲基聯苯胺（華美生物工程公司）、小牛血清（杭州四季青）、牛血清白蛋白（美國SIGMA）、賽庚啶完全抗原和單克隆抗體（北京維德維康生物技術有限公司研發中心制備保存）；豬肉、豬肝等樣本（超市）。甲醇、二氯甲烷、碳酸鈉、氯化鈉、氫氧化鈉、碳酸氫鈉、無水乙醇、乙酸乙酯、乙腈、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀均為分析純級別（國藥集團）。

儀器與設備

MK-3酶聯免疫測定儀（Thermo）；QL-901渦動儀（海門其林貝爾）；TDL-40B離心機（上海安亭科學儀器廠）；酶標板（廈門云鵬）；氮吹儀（美國organomation）；移液器（Thermo）；精密電子天平（梅特勒-托利多）。

方法

1 ELISA檢測條件的優化

1.1 最適包被濃度與最適單抗濃度的優化

將包被抗原以1：2000、1：10000、1：50000、1：250000稀釋包板，每個稀釋度包兩條作為平行。比較各組的最大吸光度和抑制率，確定最適包被濃度。

單抗設定1：2000、1：10000、1：50000、1：250000共4組稀釋度。比較各組最大吸光度和抑制率，確定最適單抗稀釋倍數。

1.2 包被液pH的優化

分別用3種不同pH值的包被液將賽庚啶包被原稀釋至最適工作濃度。比較各組最大吸光值、靈敏度點抑制、IC50值和曲線的線性，確定最適包被液pH。

1.3 封閉液的優化

分別用4種不同配方的封閉液封閉，37℃溫育2h，其余變量相同。比較各組最大吸光值、靈敏度點抑制、IC50值和曲線的線性，確定最適封閉液配方。

1.4 包被條件的優化

用包被液將賽庚啶抗原稀釋至最適工作濃度，每孔100μL，分成3組。第一組：37℃溫育2h；第二組：室溫放置2h；第三組：4℃過夜。比較各組最大吸光值、靈敏度點抑制、IC50值和曲線的線性，確定最適包被條件。

1.5 樣品溶液與單抗溶液體積比例的優化

加入樣品溶液和單抗溶液比例分別為：30μL：70μL、40μL：60μL、5 0μL ： 5 0μL、6 0μL ： 4 0μL、70μL：30μL和80μL：20μL。比較最大吸光度和抑制率，確定最適樣品與單抗體積比例。

1.6 試劑盒特異性的確定

選擇對賽庚啶類似物可樂定（Apraclonidine）、羅米非啶（Romifidine）、替扎尼定（Tizanidine）、賽拉嗪（Xylazine）、克倫特羅（Clenbuterol）、萊克多巴胺（Ractopamine）和沙丁胺醇（Salbutamol）進行測定，得到各類似物在標準曲線各點的OD值，應用 RIDAWIN軟件分析，得出類似物的IC50，從而計算其交叉反應率（CR）：

交叉反應率（CR）=IC50（CLD）/ IC50（類似物）×100%

1.7 試劑盒精密度的測定

用零標準的OD值來測定ELISA方法的可重復性，分別測定板內差、批內差和批間差。

2 樣本的添加回收試驗

樣本的前處理方法如下：

豬肉：準確稱取2±0.01g均質后的新鮮組織樣品于50mL離心管中；加入1mL 0.1M鹽酸，再加入1mL無水甲醇，室溫（25±2℃）下，充分渦動3min；4000r以上，離心10min；取100μL上清液于新的離心管中，再加入400μL 0.02M PBS，渦動30s混勻，然后進行檢測。

豬肝：準確稱取2±0.01g均質后的新鮮組織樣品于50mL離心管中；加入0.5mL 0.1M鹽酸，再加入0.5mL 1M EDTA-2Na溶液，最后加入1mL無水甲醇，室溫（25±2℃）下，充分渦動3min；4000r以上，離心10min；取100μL上清液于新的離心管中，再加入400μL 0.02M PBS，渦動30s混勻，然后進行檢測。

每個添加濃度做兩份樣品，每份樣品的提取液做兩個重復。各樣品經上述方法處理后，用優化的ELISA方法檢測，測定OD450值，用RIDAWIN軟件分析數據，得出賽庚啶的含量，并根據下式計算添加回收率。

添加回收率（%）=實測值（ng/ mL）/添加值（ng/mL）×100%

結果與分析

ELISA檢測條件的優化

1 最適包被濃度與最適單抗的優化

實驗選擇最大吸光值在2.0左右，靈敏度抑制率在80%以下為合適的抗原抗體稀釋倍數。最適包被濃度與最適單抗的優化結果見表1、表2，由表可知，隨著包被原濃度和抗體濃度的降低，最大吸光值也在降低，當抗原做1：50000稀釋，抗體做1：10000稀釋時，靈敏點抑制率為79.3%，最大吸光值和靈敏度抑制均符合要求，故確定其為最適稀釋度。

2 包被液的優化

結果見表3，由表3可知，比較3種緩沖液的最大吸光值、靈敏度點的抑制率、IC50及曲線線性，選擇0.05mol/L、pH=9.6的碳酸鹽緩沖液做為包被液。

3 封閉液的確定

分析較幾種常用的封閉液，結果見表4。選擇最大吸光值較大，IC50較低，曲線線性大于99%，靈敏度點抑制在70%～80%之間的封閉液，最終選擇5%的脫脂奶粉做為封閉液。

4 包被條件的優化分析

包被條件的優化見表5，實驗選擇最大吸光值較大，靈敏度抑制率為70%～80%，IC50在0.1ng/mL左右，線性相關系數在99%以上的數據，由表確定4℃反應16h作為試劑盒的最佳包被條件。

5 樣品溶液與單抗溶液體積比例的確定

結果見表6，樣品溶液與單抗溶液體積比為40：60時，靈敏度抑制率在70%～80%之間，最大吸光度值在2.0左右，線性相關系數為99.45%，因此確定樣品溶液與單抗溶液體積比為40：60。

6 特異性的測定

結果見表7，該單抗與賽庚啶、可樂定、羅米非啶、替扎尼定、賽拉嗪、克倫特羅、萊克多巴胺和沙丁胺醇的交叉反應率分別為100.0%、0.1%、0.05%，其余均小于0.05%，表明對賽庚啶靈敏。

7 精密度的測定

精密度通常用標準樣品的批內和批間相對標準差（RSD）或者變異系數（CV）來進行考察，一般要求CV應小于10%。精密度的測定見表8，由表8可以看出3批酶標板的板內變異系數小于5%，板間變異系數小于10%，符合要求。

樣本的添加回收率檢測

取空白樣本各5份，根據檢測限要求對樣品進行添加，每種樣本、每個濃度各做2個平行，按提取方法進行提取稀釋，所得樣本溶液進行ELISA檢測，計算添加回收率。表9、表10表明兩種組織的添加回收率均在70%～128%之間。

結語

本研究在已制備的賽庚啶抗原和單克隆抗體的基礎上，對抗原濃度、抗體濃度、包被液配方、封閉液配方、包被條件等進行了摸索和優化，研制了檢測豬肉組織中賽庚啶的ELISA方法，該方法IC50變動范圍在0.1～0.15ng/mL之間，豬組織中檢測限為0.5μg/kg，添加回收率70.0%～128.0%之間（添加濃度為0.5μg/kg和1.0μg/kg），樣本重復檢測的變異系數在2.6%～12.1%之間，具有良好的特異性、準確性和重復性，表明本ELISA方法的穩定性符合檢測要求，能夠滿足對豬組織賽庚啶檢測的需要。