試論用高效液相色譜（HPLC）檢測原料乳與乳制品中三聚氰胺的原理和方法

崔立華

摘 要：針對高效液相色譜法檢測原料乳及乳制品中三聚氰胺的方法，國家發布了GB/T 22388-2008和GB/T 22400-2008兩個推薦性標準，此兩者均規定了指定色譜柱的使用。隨著國內外色譜柱廠家生產的檢測三聚氰胺的色譜柱不斷增加，方法也應隨之優化，本文所使用的方法僅適用于TechMate色譜柱。

關鍵詞：高效液相色法 三聚氰胺

高效液相色譜法（HPLC）是20世紀60年代后期發展起來的一種分析方法，被廣泛應用于保健食品功效成分、營養強化劑、維生素類、蛋白質的分離測定等方面。針對近年來一些不法商家在牛奶中添加三聚氰胺的案例，筆者所在單位加強了乳制品中三聚氰胺的檢驗工作，在執行標準GB/ T 22388和GB/T 22400的基礎上，摸索出另一種使用HPLC檢測原料乳和乳制品中三聚氰胺的方法，通過一段時間的實驗，效果顯著，現將該方法總結歸納如下，供業界參考。

1 基本原理

用50%甲醇和乙酸鉛溶液作為原料乳和乳制品的蛋白質沉淀劑與三聚氰胺提取劑，強陽離子交換色譜柱分離，高效液相色譜—紫外檢測皿/二極管陣列檢測皿檢測，外標法定量。

2 試劑與材料

水：GB/T 6682規定的一級水；乙腈（CH3CN）：色譜純；磷酸（H3PO4）；磷酸二氫鉀（KH2PO4）；三聚氰胺溶液標準物質：1.00mg/mL；乙酸鉛溶液：稱取22g乙酸鉛（準確至0.01g），加水800mL完全溶解后，用水稀釋至1L，用濾膜過濾后備用；磷酸鹽緩沖液：0.05mol/L（稱取6.8g磷酸二氫鉀，加水800mL完全溶解后，用磷酸調節pH至3.0，用水稀釋至1L，用濾膜過濾后備用）；一次性注射皿：5mL；濾膜：水相，0.45μm；針式過濾皿：有機相，0.45μm；具塞刻度試管：50mL；移液槍：2～20μL、5～50μL、20～200μL、100～1000μL。

3 儀皿

高效液相色譜儀：配有紫外檢測皿/二極管陣列檢驗皿；分析天平：感量0.0001g稱0.01g；pH試紙：pH 0.5～5.0；溶劑過濾皿；離心機；渦旋混合皿；超聲波清洗皿。

4 測定步驟

4.1 試樣的制備

稱取混合均勻的15g乳制品樣品（準確至0.01g），置于50mL具塞刻度試管中，加入5mL乙酸鉛溶液，在加入25mL甲醇/水（1：1），渦旋混勻，加水至50mL，渦旋振蕩6min，離心10min，轉速為3000r，靜置后用一次性注射皿吸取上清液，用針式過濾皿過濾，作為分析試樣。

4.2 高效液相色譜測定

4.2.1 色譜條件：

色譜性：TechMate CR（1：5）-ST 5μm 120？ 4.6×250mm；流動相：磷酸鹽緩沖溶液—乙腈（70+30，體積比）；流速：1mL/min；柱溫：35℃；檢測波長：240nm；進樣量：20μL。

4.2.2 液相色譜分析測定

4.2.2.1 儀皿的準備

開機，用流動相平衡色譜柱，待基線穩定后，進樣檢測。

4.2.2.2 定性分析

依據保留時間一致性進行定性識別，根據三聚氰胺標準物質的保留時間，確定樣品中三聚氰胺的色譜峰。

4.2.2.3 定量分析：校準方法為外標法。

4.2.2.3.1 標準曲線的繪制

用甲醇/水（1：1）將三聚氰胺溶液標準物質逐級稀釋得1、2、5、10、20μg/mL的標準工作液，濃度由低到高進行檢測，以峰面積—濃度作圖，得到標準曲線回歸方程。

4.2.2.3.2試樣測定

按試樣分別進樣，獲得目標峰面積，根據標準曲線計算被測試樣中三聚氰胺的含量（mg/kg）。

4.2.3 結果計算

4.2.3.1 計算公式

4.2.3.2 計算結果有效數字

保留3位有效數字。

4.3 方法檢測限

檢測限為2mg/kg。