DWARF14響應獨角金內酯信號的分子機制

劉虎 姬朝光 劉坤

摘要：獨腳金內酯是一類由類胡蘿卜素衍生而來的新型植物生長調節因子，能夠從抑制根部分生、誘導側根形成、促進根毛伸長、介導根部與共生真菌和寄生植物信號通訊等多個方面調控植物生長發育。獨角金內酯受體DWARF14（D14）起源于α/β水解酶，其信號轉導機制不同于傳統植物生長調節因子受體，它遵循新型的“底物-酶-活性分子-受體”識別規律，具有生成和感知生長調節因子活性分子的雙重功能。綜述了獨腳金內酯受體D14結構及信號轉導機制最新研究進展。

關鍵詞：獨腳金內酯；生長發育；DWARF14；CLIM；分子識別機制

中圖分類號：Q94 文獻標識碼：A

文章編號：0439-8114（2018）20-0009-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2018.20.002 開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Abstract： Strigolactones（SL） is a new plant growth regulators derived from the carotenoid， which regulates the growth and development of plants， including inhibition of root branching， formation of lateral root， elongation lateral root and rhizospheric communication with symbiotic fungi and parasitic weeds. DWARF14 is the receptor of strigolactones that is originate from α/β hydrolase， whose signal transduction mechanism is different from classical growth regulators， and has the dual function of producing and sensing growth regulators active molecule. In this article， the newest research of the structure and molecular recognition mechanisms of D14 were summarized.

Key words： strigolactone；growth and development；DWARF14；CLIM；molecular recognition mechanisms

植物生長調節因子是一類能夠調控植物生長發育的有機內源物質，其不僅能從植物各個生長階段調控生長發育，而且也是免疫應答中的重要因子[1]。隨著現代生物學研究技術的進步，人們對多種植物生長調節因子及其受體結構研究取得了重要進展，其中，新型植物生長調節因子獨腳金內酯（Strigolactones，SL）能夠調控植物分枝[2]、介導寄生雜草種子萌發及共生真菌生長，尤其在磷酸鹽匱乏的環境下，高等植物會增加獨腳金內酯產量，抑制根部分生，將資源從非必需葉片、分枝轉移到主干和根系，從而使植物更易于在資源匱乏的條件下生存，這對于農業生產具有重要指導意義[3]。目前已證實獨腳金內酯受體為DWARF14（D14），與傳統植物生長調節因子受體通過非共價鍵可逆結合活性分子、循環觸發信號傳導鏈進行信號傳導不同，其遵循新型的“底物-酶-活性分子-受體”識別規律，具有生成和感知活性分子雙重功能。本文綜述了獨腳金內酯受體D14結構及信號轉導機制最新研究進展，并對其進行了展望。

1 D14具有α/β水解酶功能

獨腳金內酯受體D14與赤霉素可溶性受體GID1都由α/β水解酶超家族衍生而來[4]，兩者在結構和功能上極其相似。在α/β水解酶衍生成為D14的過程中，α/β水解酶的第一段α螺旋（αA）被兩段310螺旋（η2-η3）代替，α/β水解酶的第一段β折疊（β1）缺少。其中，位于二級結構中間區域的αT1-αT4形成帽子結構，恰好將位于核心區域的底物結合口袋封閉[5]（圖1A）。同樣起源于α/β水解酶的赤霉素受體GID1與D14不同，其帽子結構位于氨基酸序列非常特異且高度保守的N端延伸區（包含1～62位氨基酸），該延伸區的三段α螺旋（αa-αc）形成平板蓋將赤霉素結合口袋覆蓋。其中，該延伸區也是GID1相對于α/β水解酶增加的區域[6]。D14與GID1最大的不同之處在于，D14保留了α/β水解酶中的催化三聯體Ser-His-Asp，而GID1中的His被Val代替，因此GID1不具有水解酶活性[7]，而D14保留了水解酶活性。

目前已從擬南芥、水稻及牽?；ǖ榷喾N植物中鑒定并解析出獨腳金內酯受體D14晶體結構，通過結構比對發現，不同種屬的D14晶體結構幾乎可以完全疊合[5]。在AtD14-GR24晶體結構中，αB-αE分布于由7段β折疊形成的中心β片層一側，其余α螺旋位于中心β片層另一側，D14頂端的αT1-αT4空間排布成雙層V形帽子結構，由β4、β7及β6形成的催化三聯體Ser97-His247-Asp218位于獨腳金內酯結合口袋底部[8]，結合口袋在空間上足夠大，以確保具有龐大芳香環側鏈的獨腳金內酯能嵌入結合口袋（圖1B、圖1C）。

獨腳金內酯屬于萜類小分子化合物[9]，其分子結構包括三環內酯（Tricyclic lactone，ABC-OH）、烯醇醚鍵（Enol ether bridge）及羥甲基丁烯內酯（Hydroxymethyl butenolide，D-OH），ABC-OH和D-OH通過烯醇醚鍵連接在一起[10]，不同獨腳金內酯的差異性在于ABC-OH的取代基。D14水解底物的過程分多步進行，產生多種中間產物，不同產物能夠激發不同的信號通路（圖1D）。超高效液相色譜（Ultra performance liquid chromatography，UPLC）和電噴霧質譜（Electrospray mass spectrometry，ES-MS）結果表明，GR24的最終水解產物為ABC-OH和D-OH[6]。

在獨角金內酯進入結合口袋時，其A-ring部分進入結合口袋，B-ring、C-ring及D-ring完全進入結合口袋并通過氫鍵作用及疏水作用進一步被固定在口袋內部，此時的底物處于待水解狀態。在第一步水解過程中，D-ring能夠被Ser97識別并發生親核取代反應，電子從Ser97羥基基團轉移到由His247和Asp218形成的電荷傳遞網絡[6]，底物被水解成ABC-OH和中間產物1（產物1實質上是開環狀態下的D-OH）。第二步水解中，ABC-OH從疏水口袋釋放出來，與Ser97羥基基團相連的中間產物1通過氫鍵網絡（由水分子介導，H247、Y159參與形成）繼續被固定在疏水口袋內部，經由水分子介導，C1發生分子內部加成反應形成中間水解產物TMB（2，4，4，-trihydroxy-3-methyl-3-butenal，TMB）。在第三步水解過程中，TMB的C1羥基基團轉移到C4羰基上，形成最終產物D-OH。結構比對及電子密度結果發現，D14結合底物GR24前后，其構象僅發生了輕微改變，主要包括兩個方面，第一，AtD14表面柔性區的帶電氨基酸殘基構象發生了輕微變化，可能與AtD14水解獨腳金內酯過程中發生的電子轉移反應有關；第二，AtD14與底物的結合使得S97（具有水解活性）和C191（涉及到與水解活性相關的保守區域折疊）的剛性加強[11]。隨后通過相同方法比對了AtD14-GR24、AtD14-TMB及AtD14-D-OH構象，結果顯示三者表現出幾乎完全相同的表面構象。

為了進一步探究配體結合底物機制，科研工作者設計了F28W、S97C、F136V、W155F、C191V、R217H、S220I、H247A等底物結合口袋相關的突變體，通過氫氘交換（Hydrogen-deuterium exchange mass spectrometry，HDX）技術探究了AtD14與GR24（獨角金內酯的類似物）的結合情況。結果表明，R217H幾乎不影響AtD14對GR24及其水解中間物的結合，而S97C、S220I、H247A使得D14完全喪失GR24結合活性。這表明，上述除R217以外的其余氨基酸對D14與GR24的結合具有重要作用。早期研究發現，催化三聯體中的His297突變為Gla后使得D14酶活性缺失，而D14（His297Gla）喪失了與SLR1（赤霉素信號抑制因子，屬DELLA家族）的互作能力，表明D14的酶活性是D14與SLR1互作的前提[12]。同樣，在GR24誘導的D14與D3（一種F-box蛋白，與獨腳金內酯信號通路密切相關）互作過程中，D14的酶活性也是D14與D3互作的重要前提[11]。

2 D14介導的信號通路

在低濃度獨腳金內酯情況下，獨角金內酯信號抑制劑D53/SMXLs[13]結合轉錄因子TCP（Teosinte branched1/Cycloidea/Proliferating cell factor1，TCP）[14]使得獨角金內酯信號通路受到抑制。當獨腳金內酯濃度足以激發獨角金內酯信號通路時，D14識別結合獨腳金內酯將其水解為活性分子CLIM（Covalently linked intermediate molecule，CLIM），同位素標記試驗證明CLIM是由獨角金內酯的D環衍生而來的C5H5O2化合物。水解后的CLIM繼續被封閉在底物結合口袋內，隨后D14CLIM招募SCF（ASK1-CULLIN-F-BOX）復合體并與D3（屬F-box蛋白家族）蛋白結合進一步形成SCFD14復合體。SCFAtD14通過其D3蛋白特異性識別結合SL信號抑制因子D53/SMXLs，經由泛素結合酶E2介導將D53/SMXLs多泛素化修飾，最終通過26S蛋白酶體將多泛素化的D53/SMXLs降解，從而解除D53/SMXLs對SL信號通路的抑制[14]，促進下游基因表達（圖2）。其中，SCF的活性受到泛素相關蛋白（Related to ubiquitin 1，RUB1）的調控，RUB1是一種類似于泛素的蛋白，它可以共價連接到CUL1上，而RUB1對CUL1的修飾作用又受到多種酶的調節[15]。

有關研究表明，D14將獨角金內酯水解為最終產物D-OH后，D-OH充當“塞子”將底物結合口袋封閉后，在D14的αA與αB之間的疏水表面形成親水補丁，進而促進D14與SLR1的相互作用[12]，但對于D14與SLR1形成異源二聚體以后的信號通路還不甚了解。除SLR1外，DELLA家族其他成員可以與赤霉素轉錄因子PIFs[16]、茉莉酸信號抑制劑JAZs[17]、油菜素內酯轉錄因子BZR1[18]發生相互作用，其中，JAZs能夠抑制DELLA與PIFs之間的相互作用[19]，OsD14可以與赤霉素信號抑制劑SLR1相互作用[12]，而赤霉素誘導的OsGID1-SLR1的互作又能抑制OsD14-SLR1之間的互作[12]，表明DLELLA蛋白在多種信號通路中具有重要作用。此外，獨腳金內酯還與生長素共同調控不同溫度條件下根的伸長[20]，與脫落酸共同調控干旱條件下的免疫應答[21]。

3 D14傳導獨角金內酯信號的結構機制

2016年AtD14-D3-ASK1三維晶體結構被解析[22]，其結構與TIR1-ASK1復合體、COI1-ASK1復合體類似[23]。AtD14-D3-ASK1復合物整體呈現出海馬形狀，AtD14為海馬頭部，D3 LRR（Leucine-rich repeat domain of D3，D3 LRR）序列組成海馬的身體，D3 F-box（F-box motif of D3，D3 F-box）和ASK1（Arabidopsis SKP1-like1，ASK1）構成海馬尾部，位于D3氮端的F-box蛋白與ASK1連接，位于D3羧基端的LRR與D14連接。LRR首尾相連的原則在空間內螺旋折疊，空間排布成馬蹄鐵形狀，其在空間位置上正對AtD14疏水空腔（S97、H247、D218）。其中，LRR13保守性很低，可能參與蛋白之間的相互作用，LRR15、LRR16、LRR17及LRR19的α螺旋與β折疊之間都存在一段較長柔性區域，這些柔性區域涉及到D3與D14的相互作用。

D14水解GR24引發的構象變化是D14識別結合D3的前提，但D14不是直接將GR24水解成最終產物D-OH誘發兩者之間的相互作用，CLIM才是誘發D14與D3相互作用的關鍵物質，已經通過排阻色譜及串聯質譜等方法證實了這一點[22]。在AtD14-D3-ASK1復合體中，CLIM通過與AtD14的Ser297、His24形成共價鍵以及由Phe28、Phe126、Phe175、Leu179及Val194等氨基酸形成的氫鍵網絡被封閉在結合口袋內。值得注意的是，β7-αE之間柔性區域（包含Asp218）的空間位置發生了偏移，使得Ser297-His24-Asp218催化三聯體遭到破壞，阻止了CLIM的繼續水解。另外，β7-αE之間的柔性區域可能參與D14與抑制因子D53/SMXLs的相互作用[11]。

根據接觸面積大小，將D14與D3的互作界面分為兩部分，一部分由D14底物結合口袋平板蓋組成，另一部分由接近平板蓋的較短螺旋和柔性區域組成。前者包含由4個氨基酸組成的廣泛分子間氫鍵網絡，氨基酸分別為位于loop16區域的Thr599D3、Asp606D3以及位于αT3螺旋區域的Glu174AtD14、Arg177AtD14，該氫鍵網絡能夠被Thr602D3與Glu245AtD14之間的氫鍵以及Ser608D3與Val164AtD14之間的范德華力進一步穩定。后者可進一步劃分為親水和疏水兩個不同的區域，疏水區域的蛋白互作主要依靠范德華力，涉及該過程的氨基酸包括位于LRR區域的Leu609D3、Arg612D3、Leu644D3、Pro645D3、Leu649D3、Phe669D3以及位于平板蓋區域的Ala160AtD14、Val164AtD14、Phe180AtD14；親水區域的蛋白互作主要依靠AtD14部分表面區域以及D3 LRR18和LRR19形成的氫鍵網絡，AtD14部分表面區域在底物結合口袋處于開放狀態時被αT3遮蔽，關閉狀態時暴露出來。參與形成氫鍵網絡的氨基酸包括Asn11AtD14、Asp31AtD14、Ser33AtD14、Asp52AtD14、Cys55AtD14、Gly57AtD14、Val59AtD14、Asn181AtD14、His666D3、Glu667D3、His668D3、Thr699D3、Arg702D3。研究表明，F180AtD14、P161AtD14、E174AtD14、R177AtD14、D606D3、L644D3、R702D3等氨基酸的突變顯著減弱了GR24誘導的AtD14-D3之間的相互作用[11，22]。

在D14與D3相互作用的過程中，D14構象發生了巨大的變化，底物結合口袋由開放狀態轉變為關閉狀態。如圖3所示，在D14結合口袋由開放狀態轉變為關閉狀態時，αT2由螺旋狀態轉變為無規則卷曲狀態，αT2與αT1之間的柔性區（Loop between αT1 and αT2）由無規則卷曲狀態轉變為螺旋狀態，這種二級結構的轉變使得αT2能夠在空間位置上轉向αT1，αT3轉向αT4，結合口袋逐漸縮小直至完全封閉。這種轉變使得αT1-αT4最終轉變成為D14-D3互作界面，進一步促進D14與D3的相互作用。氫氘交換質譜（HDX）研究發現，D3與D14的結合增加了D14的氘交換速率，增強了D14活性，使D14處于更加“興奮”的狀態，這種興奮狀態可能更易于D14與D3的進一步相互作用。D14-D3形成異源二聚體后被SCF識別，激活下游信號通路，調控基因表達，發揮獨角金內酯的調節作用。

4 展望

在植物生長發育過程中，植物生長調節因子與生長發育信號途徑或免疫信號途徑共同形成一個既協同又拮抗的復雜調控網絡，多方面調控植物的生長發育與免疫應答反應。植物生長調節因子受體是植物生長調節因子信號轉導途徑中極其重要的參與者，對受體結構的研究有助于加深人們對生長調節因子信號識別機制的認識，為進一步研究植物生長調節因子信號轉導機制提供理論依據。在獨腳金內酯介導的信號通路中，D14對獨腳金內酯及其同源物的水解過程分多步進行，不同的水解產物誘導不同的信號通路，獨腳金內酯能夠間接參與赤霉素、茉莉酸、油菜素內酯等多種生長調節因子介導的植物生長發育調控，這些發現為認識獨腳金內酯信號通路以及獨腳金內酯與其他植物生長調節因子相耦連的信號通路提供了新的見解，但這個認識遠遠不夠，對于其精確分子識別機制以及信號通路還有待于研究。除此之外，AtD14-D3-ASK1、TIR1-ASK1、COI1-ASK1復合體結構的類似以及相似的信號識別機制為研究植物生長調節因子結構提供依據。還有研究表明，水楊酸受體NPR1可以與CUL3互作結合，說明NPR1遵循的信號通路可能與獨角金內酯、赤霉素、茉莉酸遵循的信號通路類似。探究獨腳金內酯的奧秘，為基于其結構設計新型人工植物生長調節因子提供可能，從而開啟利用外源物調控植物生長發育的新時代。

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