根際內(nèi)生菌對獼猴桃潰瘍病生防作用研究初探

崔麗紅，宋金秋，陳繼富，恩特馬克·布拉提白，田清武

（湘西民族職業(yè)技術(shù)學(xué)院，吉首 416000）

根際內(nèi)生菌對獼猴桃潰瘍病生防作用研究初探

崔麗紅，宋金秋*，陳繼富，恩特馬克·布拉提白，田清武

（湘西民族職業(yè)技術(shù)學(xué)院，吉首 416000）

對前期分離純化得到的9株根際內(nèi)生菌進(jìn)行皿內(nèi)拮抗活性試驗(yàn)，篩選出對獼猴桃潰瘍病致病菌的抑制效果明顯的JDG6、JDG16、JDG23菌株，其菌株抑菌圈平均直徑分別為13.0 mm、14.5 mm、12.5 mm，JDG16抑制效果最好。對3個(gè)菌株進(jìn)行盆栽試驗(yàn)，結(jié)果表明：當(dāng)發(fā)酵濾液稀釋100倍時(shí)，菌株JDG6，JDG16，JDG23均表現(xiàn)出較強(qiáng)的拮抗活性，可降低了獼猴桃潰瘍病致病菌入侵植株體內(nèi)的機(jī)率，抑制致病菌在植株體內(nèi)的擴(kuò)展，減輕病菌對植株的危害，為獼猴桃潰瘍病生防菌株的研究提供了一定的參考。

根際內(nèi)生菌；獼猴桃潰瘍病；抑菌活性；生物防治

獼猴桃潰瘍病（Pseudomonas syringae pv.actinidae）是由丁香假單孢桿菌變種所引起的一種病害，主要危害枝條、葉片、花蕾。該病極易傳染，極具毀滅性［1-2］。生物防治是一種以有益生物或其他生物來抑制或殺死有害生物的方法，此方法不僅對植物生長沒有影響，而且對致病菌不易產(chǎn)生抗藥性，不污染環(huán)境，不影響人類健康，是未來替代化學(xué)藥劑防治植物病害的優(yōu)先選擇［3-4］。2008年，西北農(nóng)林科技大學(xué)申哲等［5］在感潰瘍病的獼猴桃植株上噴施內(nèi)生放線菌gcLA4發(fā)酵液100倍稀釋液，以化學(xué)藥劑施那寧為對照，抑制效果明顯。2013年，四川農(nóng)業(yè)大學(xué)燕金宜［6］從獼猴桃植株枝條上分離出的內(nèi)生真菌J2，也對獼猴桃潰瘍病病原菌有較好的抗性和遺傳穩(wěn)定性，是一個(gè)具有開發(fā)潛力的生防菌株。2015年，四川出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心邵寶林等［7］通過盆栽試驗(yàn)和大田試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)從獼猴桃根際土壤中分離篩選出的芽孢桿菌B2對獼猴桃潰瘍病菌有較好的抑制效果。2016年，成都理工大學(xué)郭睿文［8］運(yùn)用牛津杯法，從獼猴桃植株中初步篩選出對獼猴桃潰瘍病有拮抗作用的23株內(nèi)生細(xì)菌，通過室內(nèi)枝條防效實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)其中的6株對獼猴桃潰瘍病致病菌的拮抗性比較穩(wěn)定。

總之，經(jīng)過十幾年來的研究，國內(nèi)外學(xué)者利用植物內(nèi)生放線菌、內(nèi)生真菌、內(nèi)生細(xì)菌和芽孢桿菌來防治獼猴桃潰瘍病的研究報(bào)道較少，而利用根際內(nèi)生菌來防治潰瘍病的研究則幾乎沒有。生產(chǎn)上，利用根際促生菌轉(zhuǎn)化的生物菌劑，對蘋果、桃、梨、草莓等［9］果樹病害進(jìn)行防治的方法已廣泛使用。因此，筆者利用前期篩選出的9株根際內(nèi)生菌［10］進(jìn)行皿內(nèi)抑菌活性試驗(yàn)和盆栽試驗(yàn)，旨在篩選出抑制獼猴桃致病菌更好的菌株，為下一步獼猴桃潰瘍病生防菌株的研究提供了一定的參考。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)苗為植株長勢相近的一年生的獼猴桃盆栽苗（品種為‘紅陽’，株高1.2 m，主莖粗1.1 cm），2016年2月下旬進(jìn)行。供試菌株為9株前期從絞股藍(lán)根及其粘附土壤中篩選出的內(nèi)生細(xì)菌：JDG6、JDG7、JDG14、JDG16、JDG18、JDG22、JDG23、JDG30、JDG32；指示菌 DX118由本地感潰瘍病的獼猴桃植株上分離篩選鑒定后得到。

以無菌水為對照，將室內(nèi)篩選得到的內(nèi)生菌株JDG6、JDG16、JDG23發(fā)酵濾液按50倍、100倍、150倍稀釋，每處理4次重復(fù)。采用噴霧法噴施待測發(fā)酵液，每5 d噴施1次，連續(xù)3次。7 d后在獼猴桃植株離地面主莖地面30—60 cm處用10號針將枝條韌皮部刺傷，刺30個(gè)部位，然后將沾有指示菌菌液（濃度1×109CFU/mL）的無菌藥棉包住傷口，套上保鮮膜，進(jìn)入常規(guī)管理。

1.2 培養(yǎng)基

內(nèi)生菌TSB培養(yǎng)基：胰蛋白胨8.5 g+大豆蛋白胨1.5 g+NaCl 2.5 g+葡萄糖1.25 g+K2HPO41.25 g+瓊脂10 g+蒸餾水500 mL，pH 7.5。

指示菌BPA培養(yǎng)基：牛肉浸膏1.5 g+蛋白胨2.5—5 g+蔗糖5 g+酵母膏5 g+瓊脂8.5 g+蒸餾水500 mL，pH 7.0。

發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖40 g+豆餅粉20 g+酵母膏2 g+ZnSO4·7H2O 0.4 g+KH2PO40.2 g，pH 7.0

1.3 生防內(nèi)生菌的室內(nèi)篩選

將前期分離得到的9株內(nèi)生菌，分別接種在TSB液體培養(yǎng)基中，在27℃，150 r/min條件下，恒溫?fù)u床培養(yǎng)24 h。將發(fā)酵液經(jīng)過濾紙過濾后在3 500 r/min下離心10 min。提取上清液，用0.22μm濾膜過濾，即得發(fā)酵濾液［11］。

將指示菌DX118接種于5 mL BPA液體培養(yǎng)基，于28℃、150 r/min搖床培養(yǎng)24 h，用無菌水稀釋制備1.5×108CFU/mL的菌懸液，取100μL指示菌懸液均勻涂布于BPA固體培養(yǎng)基上，然后將4個(gè)直徑為6 mm的圓形濾紙按十字形放置在上面，而后以其中1個(gè)滴無菌水為對照，分別用移液松提取9株內(nèi)生細(xì)菌100μL發(fā)酵濾液滴于其他3個(gè)濾紙片上，每種菌平行做3個(gè)樣，28°C培養(yǎng)。48 h后觀察各菌株的抑菌情況，并分別測量各抑菌圈的直徑，求其平均值。

1.4 根際內(nèi)生菌JDG6、JDG16、JDG23單胞分離與拮抗活性測定

采用單胞分離的方法進(jìn)一步分離純化1.3室內(nèi)篩選得到的拮抗菌株，并再次對分離得到的單胞菌株進(jìn)行抑菌活性測定［12］。

1.5 根際內(nèi)生菌 JDG6、JDG16、JDG23的盆栽試驗(yàn)

接種30 d后觀察病斑，統(tǒng)計(jì)病斑數(shù)，并用游標(biāo)卡尺測量病斑大小（即葉片病斑和枝條病斑），計(jì)算發(fā)病率、病情指數(shù)和防治效果；60 d后，再次觀察舊病斑的情況，測量舊病斑大小，統(tǒng)計(jì)新感染病班的個(gè)數(shù)，計(jì)算病斑擴(kuò)展面積、病斑增長率和相對防效。

相關(guān)數(shù)據(jù)的處理方法：

病情指數(shù)［13］、防治效果、病斑擴(kuò)展面積、病斑增長率、相對防效［14］的計(jì)算公式：病斑擴(kuò)展面積＝（舊傷口平均半徑2-原傷口平均半徑2）×3.14

表1 獼猴桃潰瘍病程度分級標(biāo)準(zhǔn)［15］Table1 Classifiedstandardsofinfectiousdegreeinbacterialcankerkiwifruit

2 結(jié)果與分析

2.1 根際內(nèi)生菌的室內(nèi)篩選結(jié)果

室內(nèi)篩選結(jié)果顯示，9株根際內(nèi)生菌中有3株對供試菌株（丁香假單胞桿菌 DX118）有不同程度的抑菌效果（圖1），其中菌株JDG16對供試菌的抑菌效果最好，抑菌圈平均直徑為14.5mm，菌株 JDG6和JDG23對其效果次之，抑菌圈平均直徑分別為13.0mm、12.5mm，而其他的根際內(nèi)生菌抑菌圈均不明顯（表 1）。

圖1 根際內(nèi)生菌JDG16、JDG6、JDG23對致病菌DX118的抑菌作用Fig1 ThebacteriostasisofrhizosphereendophytesJDG16，JDG6andJDG23onpathogenicbacteriumX118

表2 根際內(nèi)生菌JDG6、JDG16、JDG23對致病菌DX118的皿內(nèi)拮抗效果Table2 Thein-vesselantagonismeffectofrhizosphereendophytesJDG6，JDG16andJDG23onpathogenicbacteriumX118

2.2 根際內(nèi)生菌的盆栽效果

盆栽試驗(yàn)（表2和表3），當(dāng)發(fā)酵濾液稀釋100倍時(shí)，菌株JDG6，JDG16，JDG23均表現(xiàn)出較強(qiáng)的拮抗活性（表2）。其中，處理30d后的獼猴桃植株發(fā)病率明顯比對照低，均在20%以下，防治后的病情指數(shù)均小于24%，而對照為57.8%，各處理的防治效果均在60%以上。這表明根際內(nèi)生菌的發(fā)酵濾液可降低獼猴桃潰瘍病致病菌入侵植株體內(nèi)的機(jī)率，對致病病具有一定的阻礙作用。處理60d后，植株病斑增加個(gè)數(shù)較少，其病斑增長率均在21%以下，病斑擴(kuò)展面積最大為3.04cm2，擴(kuò)展面積顯著低于對照（31.42cm2），且每處理的相對防效均在80%以上。這表明JDG6、JDG16、JDG23三種菌株的發(fā)酵濾液可抑制對獼猴桃潰瘍病菌株（丁香假單胞菌DX118）在植株體內(nèi)的擴(kuò)展，可降低對植株的危害。

表3 根際內(nèi)生菌JDG6、JDG16、JDG23發(fā)酵濾液對致病菌DX118的盆栽防治效果（30 d）Table 3 The pot control efficiency of rhizosphere endophytes JDG6，JDG16 and JDG23 fermentation filtrate on pathogenic bacterium X118（30 d）

表4 根際內(nèi)生菌JDG6、JDG16、JDG23發(fā)酵濾液對致病菌DX118的盆栽防治效果（60 d）Table 4 The pot control efficiency of rhizosphere endophytes JDG6，JDG16 and JDG23 fermentation filtrate on pathogenic bacterium X118（60 d）

3 結(jié)論與討論

近年來，國內(nèi)外研究者對根際細(xì)菌中的優(yōu)勢菌種——假單胞菌的拮抗病原菌已越來越重視［16-17］，這方面的應(yīng)用研究已有些報(bào)道，但將根際內(nèi)生菌用于獼猴桃致病菌的生物防治的研究卻少之甚少。如任智等［18］、邵紅［19］、牟志美等［20］、徐大可［21］、李春宏等［22］分別對華重樓、春蘭、桑樹、越橘、棉花中的內(nèi)生菌進(jìn)行了研究，并在內(nèi)生菌的拮抗作用方面取得了較好的成果。本研究利用前期分離篩選到的9株根際內(nèi)生菌進(jìn)行皿內(nèi)拮抗活性測定，試驗(yàn)表明菌株JDG6、JDG16和JDG23抑制致病菌DX118的效果明顯高于其他6菌株，其抑菌圈直徑分別為13.0 mm、14.5 mm、12.5 mm。2015年張暉等［23］研究發(fā)現(xiàn)，香蕉根際耳炎假單胞菌對香蕉枯萎病病菌有很好的抑菌活性，與本研究結(jié)果基本一致。盆栽試驗(yàn)結(jié)果表明，JDG6、JDG16、JDG23菌株發(fā)酵液100倍稀釋液時(shí)，抑制獼猴桃潰瘍病致病菌的效果最為明顯，其中JDG16菌株的相對防效達(dá)88.86%，但與JDG6、JDG23無明顯差異。經(jīng)16 srDNA分析，這3種菌株與獼猴桃致病菌 DX118屬于假單胞菌屬，因此分析這可能是由于這三株內(nèi)生菌與獼猴桃的致病菌具有相同的生態(tài)位，在定殖過程中與獼猴桃的致病菌形成了營養(yǎng)物質(zhì)的競爭關(guān)系，使致病菌因得不到所需的營養(yǎng)物質(zhì)而被抑制或消亡，從而達(dá)到生物防治的效果。目前，本研究僅是對前期篩選出的9株根際內(nèi)生菌進(jìn)行了抑菌活性試驗(yàn)和盆栽試驗(yàn)，得到3株生防菌株對抑制獼猴桃潰瘍病效果明顯。但生防菌株對潰瘍病致病菌的抑菌效果易受環(huán)境影響，具有一定的不確定性，故將其應(yīng)用于生產(chǎn)仍有很多研究要做，下一步將對這3株菌株進(jìn)行田間防效試驗(yàn)，進(jìn)一步觀察其防治效果。

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Prelim inary exploration of biocontrol effect of rhizsphere endophyte on kiw i fruit canker

CUILi-hong，SONG Jin-qiu*，CHEN Ji-fu，ENTEMAKE·Bulatibai，TIAN Qing-wu（Xiangxi National Vocational Technical College，Jishou416000，China）

The in-vessel antagonism activity testwas conducted toward the 9 rhizosphere endophytes gained by primary stage’s separation and purification，and the JDG6，JDG16 and JDG23 bacterial strains which possessed significant inhibitory effect toward the pathogenic bacterium of kiwifruit bacterial canker were screened.Themean diameters of their inhibition zoneswere 13.0 mm，14.5 mm，and 12.5 mm.The JDG16 had the best inhibitory effect.The pot experiment was conducted toward the 3 bacterial strains.The results showed thatwhen the dilution of fermentation filtrate was 100，all JDG6，JDG16 and JDG23 had strong antagonistic activity and could decrease the invasion rate of the pathogenic bacterium of kiwifruit bacterial canker，restrain the extension of bacteria in the plantand decrease the damage of bacteria toward the plant.Thus，the results provided some reference for the research on biocontrol strain of kiwifruit bacterial canker.

Rhizosphere endophytes；Kiwi fruit canker；Bacteriostatic activity；Biological prevention

2017-03-01

湘西州2016年科技研發(fā)項(xiàng)目（重大項(xiàng)目）“獼猴桃細(xì)菌性潰瘍病抗性砧木的選育與研究”；2016年度湖南省教育廳科學(xué)研究項(xiàng)目（16C15386）；2015年度湖南省教育廳科學(xué)研究項(xiàng)目（15C1367）

崔麗紅（1979—），女，碩士，副教授，研究方向：獼猴桃栽培與育種。E-mail：153280671＠qq.com

*通信作者：宋金秋（1982—），女，碩士，講師，主要從事微生物生態(tài)及植物病害防治研究。E-mail：64190208＠qq.com

S436.634.1

A

1000-3924（2017）06-028-05

張睿）