豬圓環病毒2型培養方法的研究

何錫忠，倪建平，李春華，林 鷙，潘 潔，彭麗英*

（1上海市農業科學院畜牧獸醫研究所，上海 201106；2上海佳牧生物制品有限公司，上海 201106）

豬圓環病毒2型培養方法的研究

何錫忠1，倪建平2，李春華1，林 鷙1，潘 潔1，彭麗英1*

（1上海市農業科學院畜牧獸醫研究所，上海 201106；2上海佳牧生物制品有限公司，上海 201106）

利用有限稀釋法從含豬圓環病毒2型（PCV2）的PK15細胞中克隆得到1株含PCV2高感染比例的PK15-A8細胞株，初步研究了該克隆株中PCV2增殖的特性及穩定性。間接免疫熒光試驗結果表明，將該克隆株在方瓶中靜置培養連續傳代40代后病毒滴度最高可達107.5TCID50/mL，用生物反應器培養病毒滴度最高可達108.0TCID50/mL以上。利用常規方瓶培養細胞方法，在37℃培養96 h，收獲得到豬圓環病毒2型病毒液。本研究結果為進一步開發高效價的PCV2全病毒滅活疫苗奠定了基礎。

豬圓環病毒2型；細胞克?。徊《九囵B

以豬圓環病毒2型（Porcine circovirus type 2，PCV2）為主要致病因子引起的疾病統稱為豬圓環病毒病（PCV2-associated disease，PCVAD）。目前，PCVAD正在世界各地持續發生與流行，嚴重危害養豬業健康發展。使用PCV2疫苗免疫是目前防控豬圓環病毒病的主要手段之一，而疫苗的一個重要指標需要高滴度PCV2病毒。目前，對PCV2的培養都建立在豬腎細胞系PK15上，直接培養常因毒價低難以達到制苗所需的效價。

提高PCV2病毒滴度的方法一般是采用D-氨基葡萄糖處理細胞增強病毒的增殖能力，或者采用病毒在細胞上連續培養傳代，使分離株隨細胞傳代次數的遞增，病毒滴度有所升高［1-2］，但研制周期長，工藝復雜，產品質量較難控制，成本較高，不利于規模化生產。國內多家單位研究通過對PK15母細胞進行有限稀釋和細胞克隆，得到對PCV2具有高敏感性的細胞系［2-3］，其他類型的細胞系進行有限稀釋和細胞克隆的報道也較多。目前，國內外尚無通過含豬圓環病毒2型的PK15細胞進行細胞克隆后培養豬圓環病毒2型的報道。本研究對含豬圓環病毒2型的PK15細胞通過有限稀釋法方式克隆得到1株含PCV2高感染比例的PK15細胞株，進行培養豬圓環病毒2型，毒價可達到107.5TCID50/mL，利用微載體培養病毒毒價可達108.0TCID50/mL以上，種細胞擴大培養收獲液即為疫苗的原液。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞與毒株

PK15細胞（無PCVl污染）由國外引進，PCV2/SN07-12株（微生物保藏登記號：CCTCC NO：V201304）由上海市農業科學院畜牧獸醫研究所保存。

1.1.2 主要試劑及儀器

DMEM培養基和胎牛血清為GIBCO公司產品；特異性抗PCV2血清、PCV2間接免疫熒光試劑（韓國JBT生物技術公司）。

Retiga 2000R高敏感度冷CCD熒光數碼顯微鏡（日本OLYMPUS）、Centrifuge 5804（R）臺式高速冷凍離心機（德國Eppendorf）。生物反應器購自New Brunswick Scientific Co.Ltd.，USA。

1.2 方法

1.2.1 單個含豬圓環病毒2型PK15細胞克隆及其亞群的培養

將PCV2 SN07-12種毒接種于PK15細胞（無PCVl污染），37℃培養72 h，胰酶消化PK15細胞，采用有限稀釋法，按照每孔100μL含20%牛血清細胞生長液、0.5個細胞/孔的細胞數加入96孔板，37℃、5%CO2培養箱中培養，取有單個細胞生長的細胞孔中細胞繼續克隆培養，待細胞初步長成單層后胰酶消化，加入含10%牛血清的DMEM培養基，再一傳二對應接種到另外一96孔細胞培養板中，37℃、5%CO2飽和濕度培養箱中培養96 h，其中一塊板收獲，進行篩選鑒定。高陽性細胞孔連續克隆2次。

1.2.2 陽性含豬圓環病毒2型PK15細胞克隆株的篩選

取長滿單層96孔細胞培養板，棄去培養液，PBS洗滌細胞3次，經無水乙醇在-20℃固定2 h，封閉液洗滌1次，再用封閉液在37℃作用30 min，加PCV2特異性血清100μL，37℃作用1 h，PBS洗滌細胞3次后，加入熒光標記抗體，在37℃作用1 h，洗滌3次后加封片液（Mounting-Fluid），熒光顯微鏡下挑選熒光數量最多的克隆株為豬圓環病毒2型高感染性的PK15細胞亞群，重復克隆1次，對含豬圓環病毒2型PK15細胞株進行純化。

1.2.3 豬圓環病毒2型的增殖

利用胰酶消化含PCV2高感染比例的PK15-A8細胞系，加入細胞生長液，在37℃先培養24 h，棄生長液，加入細胞維持液，繼續培養至96 h，收獲，反復凍融，即得到豬圓環病毒2型。

1.2.4 含豬圓環病毒2型PK15-A8細胞株的傳代

將高陽性細胞孔連續克隆2次得到的含豬圓環病毒2型PK15-A8細胞株按照常規傳代細胞培養方法在中方瓶中連續傳代，每隔5代進行毒價測定，傳代至第40代。

1.2.5 IFA法測定PCV2 TCID50

將健康的PK15細胞（無PCV1污染）用胰酶消化，分裝到96孔細胞板，90μL/孔，用含細胞生長液將含PCV2高感染比例的 PK15-A8細胞系第5、10、15、20、30、35、40代次病毒液作10倍遞增稀釋 10-1→10-8，每孔10μL病毒液接種90μL PK15細胞懸液，每個稀釋度的病毒液接種96孔微量培養板一縱排8孔，同時設兩縱排正常細胞對照，震蕩后放入5%CO2飽和濕度培養箱中培養96 h。

將96孔微量培養板從37℃培養箱取出，甩掉板內液體，PBS洗滌1次，無水乙醇-20℃固定2 h，封閉液（含100 mL/L胎牛血清的PBS）洗滌1次，封閉液37℃作用30 min，加一抗37℃作用1 h，洗滌液清洗3次，加熒光標記抗體37℃作用1 h，洗滌液清洗3次，每孔加1滴Mounting-Fluid，在熒光顯微鏡下觀察試驗結果。按Reed-Muench法計算PCV2的TCID50［4］。

1.2.6 5 L生物反應器培養PCV2病毒

采用微載體濃度為5 g/L，取10、20、30、40代含PCV2高感染比例的PK15-A8細胞系的細胞接種到微載體，細胞密度4.5萬個/mg，使用低糖 DMEM培養基培養，其余培養條件按照常規方法控制，培養96 h收獲。

2 結果與分析

2.1 1株含PCV2高感染比例的PK15細胞系獲得

通過對含PCV2高感染比例的PK15細胞進行2輪克隆篩選，第2輪克隆篩選IFA法測定的陽性率為100%，獲得了1株含PCV2高感染比例的PK15-A8細胞克隆株（圖1）。該克隆細胞株培養收獲液的毒價達107.0TCID50/mL（表1）。

圖1 含豬圓環病毒2型PK 15細胞克隆株的篩選結果Fig.1 Screening of PCV2-containing cloned strain of PK15 cells

2.2 豬圓環病毒2型的增殖結果

37℃培養，收獲細胞培養物，凍融3次，即得到豬圓環病毒2型病毒液。

2.3 含豬圓環病毒2型PK15-A8細胞株的傳代結果

通過連續傳代PK15-A8細胞克隆株至第40代，觀察到PK15-A8細胞系每個代次的細胞均呈現典型的梭狀，并且形態未發生變化。對于PCV2的增殖特性試驗表明，40代后方瓶收獲細胞培養物的毒價維持在107.0TCID50/mL以上（表1）。

表1 PK15-A8細胞不同代次病毒增殖情況Table 1 PCV2 proliferation in different passages of PK 15-A8

2.4 微載體培養豬圓環病毒2型的結果

利用5 L生物反應器培養4代次病毒增殖特性比方瓶更好，毒價可達108.0TCID50/mL以上（表1）。

3 討論

3.1 過去PCV2在PK15細胞上病毒增殖滴度較低，難以達到制備全病毒滅活疫苗的要求［5-6］。本課題組利用PCV2在PK15細胞內繁殖時不產生細胞病變這一特性，又避免PK15細胞對不同PCV2種毒敏感性存在差異［7-8］。本研究對含PCV2高感染比例的PK15細胞系進行細胞克隆，挑選出含PCV2高感染比例的PK15-A8細胞克隆株。該克隆細胞株細胞形態均一、生長性能好、消化分散，連續傳代40代，病毒毒價可穩定在107.0TCID50/mL以上。

3.2 本試驗研究了利用胰酶消化含PCV2高感染比例的PK15-A8細胞系并接種于細胞培養瓶內，加入細胞生長營養液，在37℃培養24 h，棄生長液，再加入細胞維持液，于37℃培養96 h，收獲細胞培養物，凍融3次，即得到豬圓環病毒2型病毒液。省去傳統生產工藝中的種毒復壯、病毒接種、吸附和采用D-氨基葡萄糖處理細胞等工藝，優點為工藝簡單、操作方便、病毒滴度高、易于進行標準化控制，為PCV2滅活疫苗開發奠定了基礎。

3.3 國內獸用生物制品企業以前生產大多屬于采用手工作坊方式，生產成本高且生產率低，而生物反應器生產成本低產能高。因此通過生物反應器生產可以克服PCV2在培養過程中效價低的缺點，為病毒的后續研究奠定了基礎［7］。國內有些單位已通過在生物反應器微載體培養時的初始接種密度和微載體接入量的優化，使該懸浮培養系統所培養的PK15-B1細胞能達到高細胞密度352—380萬個/mL；利用NBS生物反應器自動補料程序收獲病毒液，實現了連續收獲5 d，病毒滴度均不低于107.4TCID50/mL，提高了病毒收獲率［8］。本項目組利用生物反應器培養毒價可達108.0TCID50/mL以上，不僅優于本細胞系方瓶的靜止培養，同時也優于其他細胞系培養；對于PCV2高感染比例的PK15-A8細胞系在生物反應器微載體培養，如何通過生物反應器自動補料程序收獲病毒液，進行連續收獲，有待進一步研究。

［1］ZHU Y，LAU A，LAU J，et al.Enhanced replication of porcine circovirus type 2（PCV2）in a homogeneous subpopulation of PK15 cell line［J］.Virology，2007，369（2）：423-430.

［2］彭伍平，王延輝，胡東波，等.豬圓環病毒2型PK15細胞系高敏感性細胞的克隆［J］.中國獸藥雜志，2010，44（4）：37-39.

［3］羅維，趙墩，蔣大良，等.適合豬圓環病毒2生長的PK15均質細胞株的構建［J］.湖南農業大學學報，2013，39（4）：404-408.

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［7］何錫忠，李春華，倪建平，等.用微載體系統培養PK15細胞生產豬圓環病毒2型［J］.上海農業學報，2010，26（4）：149-151.

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Study on a culturemethod of porcine circovirus type 2

HE Xi-zhong1，NIJian-ping2，LIChun-hua1，LIN Zhi1，PAN Jie1，PENG Li-ying1*

（1Animal Husbandry and Veterinary Research Institute，Shanghai Academy of Agricultural Sciences，Shanghai201106，China；2Shanghai Jiamu Biological Products Company Limited，Shanghai201106，China）

From PK15 cells containing porcine circovirus type 2（PCV2），a PK15-A8 cell strain with a high PCV2 infection rate was cloned by a limiting dilution method，and then its PCV2 proliferation characteristics and stability were preliminarily studied.The indirect immunofluorescence test showed that the cloned strain could be up to 107.5TCID50/mL in virus titer after static culture and continuous passage for40 times in a square bottle，and could be over 108TCID50/mL in virus titer after bioreactor cultivation.The PCV2 was harvested after 96-h conventional culture at37℃in a square bottle.The above results laid a foundation for further development of high-titer inactivated PCV2 totivirus vaccine.

PCV2；Cell clone；Virus culture

2016-11-02

上海市閔行區科委項目（2014MH254）

何錫忠（1966—），男，碩士，高級獸醫師，研究方向：獸醫傳染病的診斷和疫苗研制

*通信作者，E-mail：pengliying2010＠aliyun.com，Tel：021-62202534

S852.65

A

1000-3924（2017）06-049-04

程智強）