雜交鱘源惡臭假單胞菌的分離鑒定及藥敏特性研究

楊圓圓，楊移斌，曹海鵬，方 偉，林漢群，楊先樂，艾曉輝

(1.廣東省水生動物疫病預防控制中心，廣東 廣州 510222； 2.中國水產科學研究院 長江水產研究所，湖北 武漢 430223； 3.上海海洋大學，上海 201306)

雜交鱘源惡臭假單胞菌的分離鑒定及藥敏特性研究

楊圓圓1，楊移斌2，*，曹海鵬3，方 偉1，林漢群1，楊先樂3，艾曉輝2

(1.廣東省水生動物疫病預防控制中心，廣東 廣州 510222； 2.中國水產科學研究院 長江水產研究所，湖北 武漢 430223； 3.上海海洋大學，上海 201306)

對患腸炎病雜交鱘進行病原分離、鑒定及藥敏試驗，為雜交鱘腸炎病的防控提供參考。從患病雜交鱘肝、腎、脾及腸道中分離純化病原菌，經理化特性測定及16S rRNA 序列分析對其進行鑒定，開展人工感染試驗，并利用K-B法進行藥敏特性分析。結果顯示，分離到的XY4菌株是本次引發雜交鱘病害的致病菌，其對雜交鱘的LD50為1.30×106cfu·g-1。XY4菌株理化特性與惡臭假單胞菌一致，16S rRNA序列與惡臭假單胞菌同源性為100%，綜合判定XY4菌株為惡臭假單胞菌。XY4菌株對頭孢拉定、氟苯尼考及多西環素等9種抗生素高度敏感。養殖時可選用對惡臭假單胞菌敏感藥物進行防控。

惡臭假單胞菌；雜交鱘(Husodauricus♀×Acipenserschrenckii♂)；分離鑒定；藥敏特性

1992年我國第一個鱘規模化養殖場在大連瓦房店成立，標志著我國鱘商業化養殖的開端，經過20多年的發展，鱘產業逐步形成了集種業、繁育、養殖及加工于一體的完整產業鏈，我國也成為世界第一大鱘養殖國。隨著社會經濟發展，人民生活水平不斷提高，具備肉厚骨軟、營養豐富、味道鮮美及品質高等優點的鱘產品受到消費者歡迎，市場需求不斷增大，為此，我國不斷擴大鱘養殖規模以滿足市場需求。目前規模化養殖鱘種類主要有施氏鱘(Acipenserschrenckii)、西伯利亞鱘(Acipenserbaerii)、雜交鱘(Husodauricus♀×Acipenserschrenckii♂) 、匙吻鱘(Polyodonspathula)及俄羅斯鱘(Acipensergueldenstaedti)等[1]， 其中，雜交鱘因具有生長速度快、抗病能力強、懷卵量大等優勢，是僅次于西伯利亞鱘及施氏鱘的第三大鱘養殖品種[2]。但近年來隨著鱘養殖產量不斷增大，養殖集約化及密度不斷提高，鱘養殖環境越加惡劣，導致各種病害頻發，嚴重影響了鱘養殖業的健康可持續發展[3]。目前已經報道的鱘致病菌主要有嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila)[4]、維氏氣單胞菌(Aeromonasveronii)[5]、豚鼠氣單胞菌(Aeromonascaviae)[6]、類志賀鄰單胞菌(Plesimonasshigelloides)[7]、停乳鏈球菌(Streptococcusdysgalactiae)[8]、海豚鏈球菌(Streptococcusiniae)[9]、產堿假單胞菌(Pseudomonasalcaligenes)[10]、溫和氣單胞菌(Aeromonassobria)[11]、魯氏耶爾森氏菌(Yersiniaruckeri)[12]、弗氏檸檬酸桿菌(Citrobacterfreundii)[13]、瓊氏不動桿菌(Acinetobacterjunii)[14]、分枝桿菌(Mycobacterium)[15]等。

2016年8—9月，廣東河源某規模化養殖場養殖的雜交鱘陸續出現死亡，持續時間長達1個多月，發病死亡魚體長在30～40 cm，發病水溫在26～29 ℃，累計死亡約35%。本研究對發病鱘開展臨床診斷、病原分離鑒定及人工感染等實驗，從而確定病因，同時開展了病原敏感藥物篩選，旨在為鱘細菌性病害防控提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗魚

10尾瀕死雜交鱘采自廣東河源某鱘規模化養殖場，體長在30～40 cm。感染用雜交鱘購于湖北清江某鱘規模化養殖場自繁苗，規格(30±1.5) g，體格健壯，無傷病，于實驗室暫養7 d無異常后用于試驗。

1.1.2 試驗試劑

腦心浸液培養基(BHI)、腦心浸出液瓊脂(BHIA)、水解酪蛋白瓊脂(MH)、藥敏紙片及細菌生化微量鑒定管均購自杭州微生物試劑有限公司；PCR反應體系、細菌基因組DNA提取試劑盒均購自天根生化科技(北京)有限公司；測序服務及引物合成均由武漢擎科創新生物科技有限公司提供。

1.2 方法

1.2.1 臨床診斷

對雜交鱘養殖場環境進行調查，統計雜交鱘發病死亡率，確定病害主要危害對象規格；對發病瀕死雜交鱘進行臨床診斷，確定典型病癥，并通過光學顯微鏡鏡檢確定有無寄生蟲感染等，取具典型癥狀瀕死雜交鱘回實驗室作進一步分析。

1.2.2 病原菌分離

在無菌條件下，取患病瀕死并具備典型癥狀的雜交鱘的肝、腎、脾及腸道劃線于BHIA平板上，置于28 ℃恒溫培養24 h后，挑取形態、大小及顏色基本一致的菌落進行細菌再純化，獲得的細菌純培養物加入25%的甘油混勻后置于-80 ℃保存。分離菌株暫命名為XY4。

1.2.3 人工感染及LD50測定

人工感染： 將XY4菌株劃線于BHI平板上，置于28 ℃恒溫培養24 h，經無菌生理鹽水洗下菌苔，并參照麥氏比濁法調整菌懸液濃度為8.4×109cfu·mL-1。

將感染用雜交鱘分成試驗組及對照組，每組均設置3個重復，每個重復10尾雜交鱘。感染試驗采取腹腔注射法，試驗組每尾雜交鱘注射XY4菌株菌液0.1 mL，對照組相同部位注射等量無菌生理鹽水。試驗期間連續充氧，水溫控制在(28±1)℃，每隔6 h觀察雜交鱘游泳狀態，及時記錄發病死亡雜交鱘數量，同時對瀕死雜交鱘進行解剖觀察，并進行細菌再分離。

細菌半致死劑量(LD50)測定： 將XY4菌株菌液稀釋成濃度為8.4×109、8.4×108、8.4×107、8.4×106、8.4×105cfu·mL-1的菌懸液，分別注射到不同組雜交鱘體內，每尾0.1 mL，即各組每尾注射劑量分別為8.4×108、8.4×107、8.4×106、8.4×105、8.4×104cfu，對照組注射等量無菌生理鹽水，每組雜交鱘各30尾。持續觀察雜交鱘的游泳狀態，及時記錄發病死亡數量，并用概率單位圖解法[16]計算LD50。

1.2.4 形態學及生理生化特性測定

將XY4菌株接種于BHI平板上，置于28 ℃恒溫培養24 h后，觀察菌落大小、形態特征及其顏色，并進行革蘭氏染色；采用細菌微量生化鑒定管參照《常見細菌系統鑒定手冊》[17]測定分離菌株XY4的生理生化特性。

1.2.5 16S rRNA基因序列測定及系統發育分析

將菌株XY4接種于BHI培養基中，置于28 ℃振蕩培養24 h，經高速離心后收集菌體，提取DNA作為PCR擴增反應模板。細菌16S rRNA序列擴增引物為：27F，5′-AGAGTTTGATC(C/A)TGGCTCAG-3′；1492R，5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′。參照閆茂倉等[18]方法進行PCR反應擴增目的基因。擴增產物確定為目的片段后送武漢擎科生物公司純化及序列測定。

將測序獲得的16S rRNA基因序列在GenBank中進行Blast分析，根據比對結果下載同源性較高的16S rRNA序列，采用Clustal X軟件進行多序列匹配分析，通過MEGA 5.1軟件Neighbor-Joining法構建系統進化樹，1 000次Bootstrap檢驗置信度。

1.2.6 藥敏特性分析

參照NCCLS抗微生物藥物敏感性實驗執行標準采用紙片擴散法進行[19]。將XY4菌株接種于腦心浸出液培養基中，經28 ℃搖床振蕩培養24 h，用無菌生理鹽水稀釋成濃度為106cfu·mL-1的菌懸液，取150 μL菌液均勻涂于水解酪蛋白瓊脂上，貼上不同種類的藥敏紙片，置于恒溫培養箱中28 ℃培養24 h后測量各藥敏紙片的抑菌圈直徑。

2 結果與分析

2.1 臨床診斷

發病鱘養殖場養殖面積達26.67 hm2，發病死亡率達35%，發病持續了約1個月，發病鱘體長在30～40 cm，經濟損失較大。養殖水體氨氮在0.05～0.10 mg·L-1，亞硝酸鹽在0.01～0.03 mg·L-1，pH 7.5，溶氧7.0～8.9 mg·L-1，水溫26～29 ℃。經光學顯微鏡鏡檢，未發現雜交鱘體內有寄生蟲寄生，此次雜交鱘發病典型癥狀主要為雜交鱘游泳緩慢，不進食。體表無明顯癥狀，解剖發現腹腔些許血水，肝臟灰白色，脾臟嚴重充血，腸道腫脹，腸壁較薄，炎癥明顯，腸道內有黃色黏液，腸道內無食物，見圖1。

2.2 細菌分離

圖1 病魚的臨床特征Fig.1 Clinical signs of moribund fish

從患病雜交鱘的肝、腎、脾及腸道中分離純化到同一株優勢菌XY4。經人工感染試驗，試驗組雜交鱘全部死亡，而對照組未出現異常。感染發病死亡的雜交鱘出現嚴重出血，脾臟充血發黑、腸道發炎等癥狀，與自然發病病癥基本一致，并分離到與XY4相同的菌株，表明XY4株是雜交鱘腸炎的病原菌。根據表1建立試驗魚死亡率(%)與細菌劑量對數[lg(cfu)]的關系曲線：y=0.24x-1.3208(圖2)，XY4菌株對雜交鱘的半致死劑量LD50=1.30×106cfu·g-1。

表1分離株對雜交鱘LD50試驗結果

Table1Results of LD50of isolation strain in hybrid sturgeon

組別Group注射劑量Injecteddose/(cfu·unittail-1)實驗魚數量Testingfishnumber/unittail死亡數量Amountofdeath/unittail死亡率Mortality/%A84×1081010100B84×10710990C84×10610660D84×10510330E84×10410110F065%生理鹽水Physiologicalsaline1000

2.3 細菌鑒定

經鑒定管反應測定了XY4菌株生化特性，結果見表2，理化指標初步確定菌株XY4為惡臭假單胞菌。將XY4菌株的16S rRNA基因序列與GenBank中已有序列進行Blast比對，結果顯示XY4菌株與假單胞菌屬種類同源性高(100%)。選取同源性高的假單胞菌屬的16S RNA基因序列，構建系統發育樹(圖3)，結果顯示XY4菌株與惡臭假單胞桿菌Pseudomonasputida顯著聚為一枝。因此，結合理化特性，綜合判定XY4菌株為惡臭假單胞桿菌P.putida。

2.4 藥敏特性

圖2 雜交鱘死亡率(%)與細菌劑量對數 [lg(cfu)]的關系曲線Fig.2 The relation curve of hybrid sturgeon mortality with logarithm of bacteria dose

表2菌株XY4的生理生化試驗結果

Table2Biochemical characteristics of strain XY4

試驗項TestitemXY4Pseudomonasputida[17]運動性Motility++精氨酸雙水解酶Argininedihydrolase++脲酶Urease--檸檬酸鹽Citrate++葡萄糖產氣Glucosegas--葡萄糖產酸Glucoseacidproduction--H2S產生H2Sproduction--明膠Gelatin--氧化酶Oxidase++硝酸鹽還原Nitratereduction++鳥氨酸脫羧酶Ornithinedecarboxyla--賴氨酸脫羧酶Lysindecarboxylase--V?P試驗V?Ptest--乳糖Lactose--甲基紅Methylred--果糖Fructose++木糖Xylose--阿拉伯糖Arabinose--麥芽糖Maltose--吲哚反應Indoletest--肌醇Inositol--接觸酶Catalase++

+，陽性positive；-，陰性negative。

藥敏試驗結果(表3)顯示：XY4菌株對頭孢拉定、氟苯尼考及多西環素等9種抗生素高度敏感；對諾氟沙星、紅霉素及新霉素等4種抗生素中度敏感；對苯唑西林、青霉素及阿莫西林等6種抗生素耐藥。

圖3 XY4菌株16S rRNA 基因序列與相關菌株的系統發育樹Fig.3 Phylogenetic tree of XY4 16S rRNA gene sequence and its relative strains

表3XY4菌株藥敏試驗結果

Table3Antibiotic sensitivity test of strain XY4

藥物Drug抑菌圈直徑判斷標準Judgmentstandardofinhibitionzonediameter/mm耐藥Resistant中度敏感Mediumsensitivity高度敏感Highlysensitive藥物含量Dose/(μg·disc-1)抑菌圈直徑Inhibitionzonediameter/mm敏感性Sensitivity環丙沙星Ciflox≤1516～20≥21522S苯唑西林Oxacillin≤1011～12≥1310R青霉素Penicillin≤1920～27≥2810?14R頭孢拉定Cefadroxil≤1415～17≥183020S阿莫西林Amoxicillin≤1314～17≥182013R呋喃唑酮Furazolidone≤1415～16≥173000R氯霉素Chloramphenicol≤1213～17≥1830022S氟苯尼考Florfenicol≤1213～17≥187522S克林霉素Clindamycin≤1415～20≥2120R諾氟沙星Norfloxacin≤1213～16≥171016I頭孢噻肟Cefotaxime≤1415～22≥233014R紅霉素Erythrocin≤1314～22≥231516I新霉素Neomycin≤1213～16≥173016I卡那霉素Kanamycin≤1314～17≥183017I多西環素Doxycycline≤1213～15≥163016S左氧氟沙星Levofloxacin≤1314～16≥17522S妥布霉素Tobramycin≤1213～14≥151020S慶大霉素Gentamicin≤1213～14≥151021S阿米卡星Amikacin≤1415～16≥173020S

S，高度敏感； I，中度敏感；R，耐藥。*，青霉素含量的單位是U·片-1。

S， Highly sensitive; I， Medium sensitivity; R， Resistant. *， The dose of penicillin is U·disc-1.

3 討論

3.1 惡臭假單胞菌的鑒定

惡臭假單胞菌分類地位為假單胞菌科、假單胞菌屬，是革蘭氏陰性桿菌。本試驗通過革蘭氏染色、形態學觀察及微量生化鑒定管等研究了XY4菌株主要形態學及理化特征，結果表明XY4菌株為革蘭氏陰性桿菌，形態學及理化特征亦與惡臭假單胞菌一致。此外，通過對XY4菌株的16S rRNA基因序列進行測序，經在GenBank中進行比對并構建系統發育樹分析表明，分離菌株XY4與惡臭假單胞菌聚為一枝。因此，結合分離株XY4的形態學、理化特征及系統發育分析，綜合判定菌株XY4是惡臭假單胞菌，而在人工感染發病死亡鱘體內相同部位亦分離到經鑒定與XY4即惡臭假單胞菌一致的菌株，故確定XY4株即惡臭假單胞菌為本次雜交鱘發病的病原菌。

3.2 惡臭假單胞菌的危害

惡臭假單胞菌在土壤及自然水體中分布廣泛，在自然界中屬正常菌群。惡臭假單胞菌具備較強分解能力，故可以將多種有機物作為能量來源，因此常被篩選為各種降解功能菌，嘗試使用其作為環境改良劑用于廢水處理等[20]。但隨著研究的深入，發現惡臭假單胞菌也是一類條件致病菌，其致病性取決于魚體生理狀態及水環境的變化。惡臭假單胞菌在世界范圍可以使得淡水魚發病[21]。近年來，關于假單胞菌引起水生動物發病病例報道日趨增多，已報道惡臭假單胞菌可引起歐洲鰻鱺爛鰓病[22]、中華絨螯蟹爪無力[23]、條石鯛爛尾白濁病[18]、三疣梭子蟹牛奶病[24]、大鯢肝壞死病[25]、羅氏沼蝦黃鰓和黑鰓病[26]、黑鯛腸炎[27]及大黃魚內臟白點病[21，28]等。同時惡臭假單胞菌還是一種人-禽-魚共患病原菌，據報道可以引起鴨[29]等禽類發病及造成人食物中毒[30]等。本研究從患腸炎病雜交鱘體內分離到惡臭假單胞菌病原，其癥狀與黑鯛腸炎病類似[27]，經感染試驗，確定惡臭假單胞菌為雜交鱘致病菌。關于惡臭假單胞菌作為雜交鱘病原在國內尚屬首次報道，表明惡臭假單胞菌感染養殖種類范圍正在擴大，其危害性進一步增強。同時，鑒于惡臭假單胞菌還會對食品安全和人體健康構成一定威脅，加強其食源溯源傳播的可能性研究十分必要。

3.3 雜交鱘腸炎病的藥物防治

本研究測定了雜交鱘腸炎病致病菌XY4對19種抗生素的敏感性，研究結果表明，XY4株對頭孢拉定、氟苯尼考及多西環素等9種抗生素高度敏感；對諾氟沙星、紅霉素及新霉素等4種抗生素中度敏感；對苯唑西林、青霉素及阿莫西林等6種抗生素耐藥。本研究分離菌株XY4對慶大霉素及多西環素高度敏感與任燕等[28]研究結果相同，而對氟苯尼考的高度敏感卻與許斌福等[21]報道的不同，可能是因為菌株來源、地理環境及用藥情況等不同造成的。經挑選高度敏感藥物多西環素，參考水產用商品藥說明書使用，配合復合維生素伴餌投喂5 d后病鱘停止死亡，7 d后大部分雜交鱘恢復正常攝食，經后續伴餌投喂大蒜素10 d鞏固療效，未出現新的死亡，取得了較好的治療效果。

[1] 孫大江， 曲秋芝， 張穎， 等. 中國的鱘魚養殖[J]. 水產學雜志，2011，24(4)：67-70.

SUN D J， QU Q Z， ZHANG Y， et al. Sturgeon aquaculture in China[J].ChineseJournalofFisheries， 2011， 24(4)：67-70. (in Chinese with English abstract)

[2] 崔禾， 何建湘， 鄭維中. 我國鱘魚產業現狀分析及發展建議[J]. 中國水產，2006(6)：8-10.

CUI H， HE J X， ZHENG W Z. Analysis and development proposals about the status of the our sturgeon industry[J].ChinaFisheries， 2006(6)：8-10. (in Chinese)

[3] 田甜， 楊元金， 王京樹， 等. 鱘魚病害研究進展[J]. 湖北農業科學，2012，51(3): 559-563

TIAN T，YANG Y J，WANG J S， et al. Research progress in sturgeon diseases[J].HubeiAgriculturalSciences， 2012， 51(3)：559-563. (in Chinese)

[4] 李圓圓， 曹海鵬， 何姍， 等. 鱘源致病性嗜水氣單胞菌X1的分離鑒定與藥敏特性研究[J]. 微生物學通報. 2008， 35(8)：1186-1191.

LI Y Y， CAO H P， HE S， et al. Isolation and identification ofAeromonashydrophilastrain X1 fromAcipenserbaeriiand its antibiotic sensitivity[J].MicrobiologyChina， 2008， 35(8)：1186-1191. (in Chinese with English abstract)

[5] 趙鳳岐， 曹謹玲， 劉青. 西伯利亞鱘敗血癥病理學觀察與病原學研究[J]. 水生生物學報，2009，33(2)：316-323.

ZHAO F Q， CAO J L， LIU Q. Study on pathology and etiology of hemorrhagic septicemia inAcipenserbaerii[J].ActaHydrobiologySinica， 2009， 33(2)：316-323. (in Chinese with English abstract)

[6] 曹海鵬， 楊先樂， 高鵬， 等. 鱘細菌性敗血綜合征致病菌的初步研究[J]. 淡水漁業，2007，37(2)：53-56.

CAO H P， YANG X L， GAO P， et al. Preliminary study of the pathogens isolated from bacterial septicaemia syndrome of sturgeon[J].FreshwaterFisheries， 2007， 37(2)：53-56. (in Chinese with English abstract)

[7] 王小亮， 徐立蒲， 曹歡， 等. 鱘致病性類志賀鄰單胞菌的鑒定、致病性及藥敏特性[J]. 微生物學報，2013，53(7)：723-729.

WANG X L， XU L P， CAO H， et al. Identification and drug sensitivity of aPlesiomonasshigelloidesfrom diseased sturgeons[J].ActaMicrobiologicaSinica， 2013， 53(7)：723-729. (in Chinese with English abstract)

[8] 潘厚軍， 劉曉勇， 常藕琴， 等. 西伯利亞鱘停乳鏈球菌的分離、鑒定與致病性[J]. 中國水產科學，2009，16(6)：891-904.

PAN H J， LIU X Y， CHANG O Q， et al. Isolation， identification and pathogenicity ofStreptococcusdysgalactiaefrom Siberians turgeon，Acipenserbaerii[J].JournalofFisherySciencesofChina， 2009， 16(6)：891-904. (in Chinese with English abstract)

[9] 王小亮， 徐立蒲， 王靜波， 等. 雜交鱘海豚鏈球菌的分離、鑒定及藥物敏感性[J]. 微生物學報，2014，54(4)：442-448.

WANG X L， XU L P， WANG J B， et al. Isolation， identification and drug sensitivity ofStreptococcusiniaefrom hybrid sturgeons(Husodauricusfemale×Acipenserschrenckimale)[J].ActaMicrobiologicaSinica， 2014， 54 (4)：442-448. (in Chinese with English abstract)

[10] XU J， ZENG X， JIANG N， et al.Pseudomonasalcaligenesinfection and mortality in cultured Chinese sturgeon，Acipensersinensis[J].Aquaculture， 2015， 446:37-41.

[11] 肖艷翼， 王斌， 夏永濤， 等. 鱘病原性溫和氣單胞菌的分離鑒定及藥敏試驗[J]. 南方農業學報，2015，46(10)：1909-1914.

XIAO Y Y， WANG B， XIA Y T， et al. Isolation， identification and drug sensitivity test of pathogenicAeromonassobriafrom sturgeon[J].JournalofSouthernAgriculture， 2015， 46(10)：1909-1914. (in Chinese with English abstract)

[12] 楊移斌， 夏永濤， 鄭衛東， 等. 鱘源魯氏耶爾森菌的分離鑒定及藥敏特性研究[J]. 水生生物學報，2013，37(2)：393-398.

YANG Y B， XIA Y T， ZHENG W D， et al. Isolation and identification ofYersiniaruckerifromAcipenserbaeriiand its antibiotic sensitivity[J].ActaHydrobiologySinica， 2013， 37(2)：393-398. (in Chinese with English abstract)

[13] 楊移斌， 夏永濤， 趙蕾， 等. 鱘源弗氏檸檬酸桿菌分離鑒定及藥敏特性研究[J]. 水生生物學報，2013，37(4)：766-771.

YANG Y B， XIA Y T， ZHAO L， et al. Isolation and identification ofCitrobacterfreundiifrom Amursturgeon (AcipenserschrenckiiBrandt) and its antibiotic sensitivity[J].ActaHydrobiologicaSinica， 2013， 37(4)：766-771. (in Chinese with English abstract)

[14] 毛芝娟， 毛甬州， 汪建萍. 兩株魚源瓊氏不動桿菌的分離， 鑒定和耐藥特性分析[J]. 水產學報，2013，37(10)：1572-1578.

MAO Z J， MAO Y Z， WANG J P. Isolation， identification and drug-resistance genes detection ofAcinetobacterjuniifrom fish[J].JournalofFisheriesofChina， 2013， 37(10)：1572-1578. (in Chinese with English abstract)

[15] 張德鋒， 李愛華， 龔小寧. 鱘分枝桿菌病及其病原研究[J]. 水生生物學報，2014，38(3)：495-504.

ZHANG D F， LI A H， GONG X N. Research on theMycobacteriumand its pathogen in sturgeon[J].ActaHydrobiologicaSinica， 2014， 38(3)：495-504.

[16] 徐叔云， 卞如濂， 陳修. 藥理實驗方法學 [M]. 北京：人民衛生出版社，2002.

[17] 東秀珠， 蔡妙英. 常見細菌系統鑒定手冊 [M]. 北京：科學出版社. 2001.

[18] 閆茂倉， 單樂州， 馬愛敏， 等. 條石鯛爛尾白濁癥病原菌的分離鑒定及系統發育分析[J]. 上海海洋大學學報，2010，19(1)：50-55.

YAN M C， SHAN L Z， MA A M， et al. Identification and phylogenetic analysis of a pathogenic bacterial strain isolated fromOplegnathusfasciatuswith tail rot and whitish symptom[J].JournalofShanghaiOceanUniversity， 2010， 19(1)：50-55.

[19] WIKLER M A. Performance standards for antimicrobial susceptibility testing[M]19th ed. Washington， D.C.， USA:Clinical Laboratory Standards Institute， 2009.

[20] 楊海洋， 李軼，胡洪營，等. 惡臭假單胞菌對硝基苯污染河水的修復研究[J]. 安全與環境工程，2008，15(1)：54-57.

YANG H Y， LI Y， HU H Y， et al. Bioremediation of nitrobenzene-contaminated river water usingPseudomonasputida[J].SafetyandEnvironmentalEngineering， 2008， 15(1)：54-57. (in Chinese with English abstract)

[21] 許斌福， 程海華， 池洪樹， 等. 大黃魚內臟白點病的病原分析與鑒定[J]. 福建農業學報，2015(7)：631-635.

XU B F， CHENG H H， CHI H S， et al. Identification of pathogen responsible for white-spots disease inLarimichthyscrocea[J].FujianJournalofAgriculturalSciences， 2015(7)：631-635. (in Chinese with English abstract)

[22] 樊海平. 惡臭假單胞菌引起的歐洲鰻鱺爛鰓病[J]. 水產學報，2001，25(2)：147-150.

FAN H P. Study on the gill-rot disease ofAnguillaanguillainfected byPseudomonasputida[J].JournalofFisheriesofChina， 2001， 25(2)：147-150.

[23] 余為一，李槿年，祖國掌. 一株中華絨螯蟹病原菌的研究初報[J]. 安徽農業大學學報，1999，26(2)：174-177.

YU W Y， LI J N， ZU G Z. A preliminary report on a pathogenic bacterium fromEriocheirsinensi[J].JournalofAnhuiAgriculturalUniversity， 1999， 26(2)：174-177. (in Chinese with English abstract)

[24] 王高學，黃增榮，袁明. 三疣梭子蟹牛奶病病原的分離鑒定[J]. 西北農林科技大學學報(自然科學版)，2007，35(6)：29-33

WANG G X， HUANG Z R， YUAN M. Isolation and identification of the pathogen of milk disease cultured in swimming crabPortunustritubercularus(portunidae)[J].JournalofNorthwestA&FUniversity(NaturalScienceEdition)， 2007， 35(6)：29-33. (in Chinese with English abstract)

[25] 趙虎，張鵬，陳玖華，等. 大鯢惡臭假單胞菌的分離及鑒定[J]. 河南水產，2008,77(4)：40-41.

ZHAO H， ZHANG P， CHEN J H， et al. Isolation and identificationPseudomonasputidafrom giant salamander[J].HenanFisheries， 2008， 77(4)：40-41. (in Chinese)

[26] 陶保華，石和榮，黃俊文，等. 假單胞菌引起羅氏沼蝦黃鰓、黑鰓病的研究[J]. 中山大學學報(自然科學版)， 2000， 39(21)：255-259.

TAO B H， SHI H R， HUANG J W， et al. Studies on yellow and black gills ofMacrobrachiumrosenbergiicaused byPseudoonas[J].JournalofSunYatsenUniversity(NaturalScienceEdition)， 2000， 39(21):255-259. (in Chinese with English abstract)

[27] 毛芝娟，王美珍，陳吉剛，等. 黑鯛腸炎病原惡臭假單胞菌的分離和鑒定[J]. 漁業科學進展，2010， 31(3)：23-28.

MAO Z J， WANG M Z， CHEN J G， et al. Isolation and characterization ofPseudomonasputida， a causative agent of gastroenteritis in black sea bream，Sparusmicrocephalus[J].ProgressinFisherySciences， 2010， 31(3)：23-28. (in Chinese with English abstract)

[28] 任燕，陳獻稿，劉鵬威，等. 大黃魚假單胞菌病病原的分離鑒定及藥物敏感試驗[J]. 廣東農業科學，2012，39(18)：151-154.

REN Y， CHEN X G， LIU P W， et al. Isolation， identification and the sensitivity to antimicrobial agents ofPseudomonassispathogen from Great yellow croaker(Pseudosciaenacrocea)[J].GuangdongAgriculturalSciences， 2012， 39(18)：151-154. (in Chinese with English abstract)

[29] 於劍，聶奎，密金鈴，等. 一株鴨源惡臭假單胞菌的序列測定與分析[J]. 西南師范大學學報(自然科學版)， 2008，33(3)： 99-104.

YU J， NIE K， MI J L， et al. Sequencing and phylogenetic analysis 16S rDNA of a strain ofPseudomonasputidaisolated from duck[J].JournalofSouthwestNormalUniversity(NaturalScienceEdition)， 2008， 33(3)：99-104. (in Chinese with English abstract)

[30] 李慶山， 邢瑞云， 張芳萍， 等. 首次發現的惡臭假單胞菌引起的食物中毒[J]. 中國公共衛生，2000，16(1)：50-51.

LI Q S， XING R Y， ZHANG F P， et al. The discovery of food-poisoning caused byPsendomonasputidafor the first time[J].ChinaPublicHealth， 2000， 16(1)：50-51. (in Chinese with English abstract)

Isolation，identificationandantibioticsensitivityofPseudomonasputidafromhybridsturgeon(Husodauricus♀×Acipenserschrenckii♂)

YANG Yuanyuan1， YANG Yibin2，*， CAO Haipeng3， FANG Wei1， LIN Hanqun1， YANG Xianle3， AI Xiaohui2

(1.GuangdongProvincialCenterforAquaticAnimalDiseasePreventionandControl，Guangzhou510222，China; 2.YangtzeRiverFisheriesResearchInstitute，ChineseAcademyofFisherySciences，Wuhan430223，China; 3.ShanghaiOceanUniversity，Shanghai201306，China)

The isolation， identification and antibiotic sensitivity of pathogen from the morbid hybrid sturgeon were conducted to provide a reference for control and prevention disease for hybrid sturgeon. The pathogenic bacteria were isolated and purified from liver， kidney， spleen and intestinal tract of hybrid sturgeon. The biochemical identification and 16S rRNA gene sequence determination and the artificial infection test were used to identify whether the strain XY4 was the pathogen， and the antimicrobial susceptibility test was conducted by K-B method. The results showed that strain XY4 was the pathogens of hybrid sturgeon， the LD50of the isolate was counted to 1.30×106cfu·g-1. According to morphological and biochemical characteristics as well as the result of 16S rRNA gene sequence analysis， the isolated strain XY4 wasPseudomonasputida. Strain XY4 was susceptible to cefadroxil， florfenicol， doxycycline and other 6 kinds of antibiotics. The disease caused byPseudomonasputidacan be prevented by above sensitive drugs in fishery farming.

Pseudomonasputida; hybrid sturgeon(Husodauricus♀×Acipenserschrenckii♂); isolation and identification; antimicrobial susceptibility

浙江農業學報ActaAgriculturaeZhejiangensis， 2017，29(12): 1978-1985

http://www.zjnyxb.cn

楊圓圓，楊移斌，曹海鵬，等. 雜交鱘源惡臭假單胞菌的分離鑒定及藥敏特性研究[J].浙江農業學報，2017，29(12): 1978-1985.

10.3969/j.issn.1004-1524.2017.12.04

2017-04-11

公益性行業(農業)科研專項(201503108-CC-1，201203085)

楊圓圓(1984—)，女，湖南婁底人，助理工程師，主要從事水生動物病害診斷及其防控技術研究。E-mail：ykyyy9@126.com

*通信作者，楊移斌，E-mail: yangyb1988@126.com

S941.42

A

1004-1524(2017)12-1978-08

(責任編輯盧福莊)