鐵線蓮屬植物葉綠體微衛星引物開發及其遺傳分析

陳文超，蘇琬涵，劉志高，季夢成

(浙江農林大學 風景園林與建筑學院，浙江 臨安 311300)

鐵線蓮屬植物葉綠體微衛星引物開發及其遺傳分析

陳文超，蘇琬涵，劉志高*，季夢成

(浙江農林大學 風景園林與建筑學院，浙江 臨安 311300)

對GeneBank數據庫中Clematisfuscavar.coreana葉綠體全基因組進行了分析，以此為基礎設計出11對葉綠體SSR引物，并進一步研究了11對葉綠體SSR引物在鐵線蓮屬其他野生種類和栽培品種中的通用性。結果表明，C.fuscavar.coreana葉綠體基因組內共有67個SSR位點，主要分布于1 088～41 445 bp和50 135～127 217 bp，以A/T單堿基重復為主；設計所得11對cpSSR引物在鐵線蓮野生種類和栽培品種中均表現出良好的通用性，在55個鐵線蓮樣本中擴增等位基因數(Na)平均為10.91，有效等位基因數(Ne)平均為5.40，主等位基因頻率(MAF)平均為0.31，多態信息含量(PIC)平均為0.79。另外，基于cpSSR數據，對55個樣本的UPGMA聚類結果進行了初步討論。

鐵線蓮屬；葉綠體微衛星；引物開發；等位基因

葉綠體基因組通常為母性遺傳，基因變異概率低且進化速率緩慢，因而被廣泛應用于植物分類及系統進化分析[1-2]。葉綠體微衛星(Chloroplast simple sequence repeat，cpSSR)在基因組中出現的頻率較高[3-4]，與核SSR(Simple sequence repeat)相比，既具有共顯性遺傳、多態性豐富的特點，又保持了葉綠體基因組的單親遺傳模式，幾乎不發生重組，在遺傳多樣性、群體遺傳結構、親緣地理學和雜種鑒定方面被廣泛應用，是一種高效的分子標記技術。

鐵線蓮屬(Clematis)是毛茛科中包含種類最多的一屬，分布于北溫帶[5]，世界范圍內約有鐵線蓮屬植物300余種[6-7]，多為木質藤本。本屬植物花型、花色多樣，觀賞栽培品種豐富，被譽為藤本皇后，深受家庭園藝愛好者的喜愛。鐵線蓮屬植物含有類黃酮、三萜皂苷等化學成分，具有很高的藥用研究價值。有關該屬植物分類和系統進化方面的研究已取得許多重要結果[8-10]，但屬內仍有多個組別的鐵線蓮分類學地位并未明確[11-13]。目前，已有多種分子標記方法用于鐵線蓮屬植物系統進化及遺傳多樣性研究。Gardner等[14]利用ISSR標記對32個藤本鐵線蓮品種和5個直立型品種的親緣關系進行了分析；RAPD標記被用于鑒定鐵線蓮雜交種[15]；atpB-rbcLspacer region、matK、trnK、trnLintron、trnL-trnFspacer region等葉綠體基因組序列被應用于鐵線蓮屬種間遺傳多樣性分析[16-17]，蔣明等[18]和李驍等[19]對共計14種藥用鐵線蓮屬植物的ITS序列進行了分析，并構建了系統發育樹。但有關鐵線蓮屬植物葉綠體SSR標記的開發與應用尚未見報道。本研究在GeneBank數據庫中搜索到Clematisfuscavar.coreana的葉綠體全基因序列，以此為基礎進行cpSSR引物開發，并用于鐵線蓮野生種和栽培種之間遺傳信息的檢測，篩選出的cpSSR引物可作為本屬植物系統發育、群體遺傳結構等遺傳信息檢測和研究的有效工具。

1 材料與方法

1.1 材料

1.2 方法

1.2.1 cpSSR位點搜尋與引物開發

從GeneBank數據庫(http: //www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez)下載C.fuscavar.coreana的葉綠體全基因組序列(GenBank No. KM652489.1)，用Misa軟件分析其SSR位點信息，參數設置：單堿基、二堿基和三堿基重復微衛星最小重復次數分別為10、6和4，四堿基和四堿基以上微衛星最小重復次數為3。使用微軟Windows 7系統的記事本和Excel 2007軟件打開Misa軟件的分析結果文件*.statistics和*.misa，查看和統計C.fuscavar.coreana葉綠體基因組序列全長、SSR位點數量和具體分布位置、不同類型SSR占比等信息。利用Primer Premier 5軟件，按照引物長度20～25 bp，PCR產物100～300 bp，退火溫度50～65 ℃，正、反向引物退火溫度之差在5 ℃以內，GC含量30%～60%設計引物，盡量避免引物出現二級結構。

1.2.2 DNA提取、PCR擴增與產物檢測

使用E.Z.N.A Plant DNA Mini Kit Spin Protocol (Omega Bio-tek)試劑盒提取葉片基因組DNA。PCR總反應體系為20 μL:ddH2O 11 μL，10× buffer 2 μL，dNTP(10 mmol·L-1)0.4 μL，Dynazyme II DNA polymerase 0.6 μL，DNA(約20 ng)2 μL，引物各2 μL。PCR反應程序：94 ℃ 45 s；94 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s，35個循環；72 ℃ 5 min。PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳初步檢測后，使用Qsep100毛細管電泳(中國臺灣產)測定產物片段大小。

1.2.3 數據分析

使用Powermarker V3.25和Popgene 3.2軟件統計主等位基因頻率、等位基因數、有效等位基因數、多態信息含量等信息，并依據Nei’s遺傳距離，采用UPGMA法構建系統進化樹[20]。

表1供試材料信息

Table1Information of samples

*表示野生種

* means wild species

2 結果與分析

2.1 葉綠體SSR的分布特征

C.fuscavar.coreana的葉綠體基因組全序列長度為159 609 bp，從1 088 bp到158 278 bp共分布有67個SSR位點。經統計，SSR位點序列總長度777 bp，為葉綠體基因組長度的0.5%；其中，單堿基重復微衛星50個，占比74.63%，A和T是主要重復單元，分別占38.0%和60.0%，G僅出現1次，C沒有出現；二至四堿基微衛星包括14種基元，二堿基微衛星共3個(占4.5%)，所含基元僅TA一種；三堿基微衛星共4個(占6.0%)，含有4種基元；四堿基微衛星共10個(占14.9%)，含9種基元，其中ATAA出現了2次，占微衛星總數的3.0%(表2)。cpSSR在整個葉綠體基因組中分布并不均勻，在1 088～41 445 bp(占總長度25.3%)和50 125～127 217 bp(占總長度48.3%)區域相對密集，分別有27(占40.3%)和38(占56.7%)個微衛星。而在起始區域1～1 087 bp沒有SSR位點分布，末尾區域157 054～159 609 bp僅有2個SSR位點。

2.2 cpSSR引物設計結果

使用Primer Premier 5對隨機挑選的5個單堿基重復微衛星[A]11、[A]14、[G]10、[T]10、[T]13及二堿基及以上重復的17個微衛星位點進行引物設計。共篩選獲得11對引物，具體信息見表3。

2.3 cpSSR引物檢測結果

引物在11種野生鐵線蓮的46個樣本和9個栽培品種的9個樣本中，共得到120條產物帶，毛細管檢測結果清晰、明確(圖1)。各引物對在仙女座、倪歐碧、粉香檳、吉恩斯、面白和雪舞等6個栽培品種中均未能得到擴增產物，所得產物片段大小為191～303 bp。由表4可知，得到有效擴增產物的55個樣本(野生種和栽培品種)中：產物條帶數7～18，平均10.91；有效條帶數3.92～8.33，平均5.40；主等位基因頻率0.22～0.44，平均0.31；多態信息含量0.72～0.88，平均0.79，其中，引物Clecp3多態信息含量最高，Clecp9最低(表4)。11個cpSSR位點均呈現良好的多態性，多態基因位點百分比為100%。

2.4 聚類分析

由UPGMA法構建的系統發育樹(圖2)可知，在Nei’s遺傳距離0.886 5處(圖2虛線位置)，55個鐵線蓮樣本分別聚為5組。10個野生種類聚集在第Ⅰ～Ⅳ組，1個野生種類和9個栽培品種聚集在第Ⅴ組。其中，單葉鐵線蓮的3個樣本單獨聚為1組(Ⅰ)，柱果鐵線蓮、山木通共18個樣本和女萎、短尾鐵線蓮共17個樣本分別聚為2組(Ⅱ和Ⅲ)，圓錐鐵線蓮、安徽鐵線蓮、大花威靈仙、天臺鐵線蓮和毛蕊鐵線蓮共6個樣本聚集為第Ⅳ組，毛萼鐵線蓮和9個栽培品種共11個樣本集合為第Ⅴ組。

表2C.fuscavar.coreana葉綠體微衛星基元組成信息

Table2Repeat motifs in cpDNA ofC.fuscavar.coreana

表311對引物信息表

Table3The information of 11 pairs of cpSSR primer

標記位點在基因組中的位置重復類型引物序列退火溫度產物大小LocusLocationRepeattypesPrimersequences(5′to3′)TM/℃Productsizes/bpClecp1rps16/trnKintergenic[ATA]4F：AAATGCCAATCCAACA48218R：CCCGGATAAGATAAATGAClecp2psbE/petLintergenic[ATT]4F：ATGTGCCATTCAAGAT49184R：TGGCGGGAATAGAAATClecp3trnS/trnVintergenic[TTG]6F：GAAATTCCCTTGGTTG48269R：CATTGAAACGCTTACTTClecp4atpB/rbcLintergenic[AAAG]3F：CCGTTGTTTCTTATTT44267R：TGAAAGTTTCGCATTAClecp5rpl16intron[AGAA]3F：AAGGGATATGGATAAATGG53277R：TGACTAGGCCCGAACTClecp6rps16/trnKintergenic[AGAT]3F：TGACCCAAGAAATCCC51181R：CCATAGGCTCATAAAGAATClecp7ndhH/rps15intergenic[ATAA]3F：ACCGTTGGTAGAGTTT48284R：AATTAAGAACCGAAGCClecp8trnKintron[ATAA]3F：TTGATGGGTGTTGAGG50274R：ACTCCTGGCTTATTTGClecp9ycf1intron[CATT]3F：TTTGCGGTACTAATCT48246R：TATCACAAGCCCAAGTClecp10rpl14/rpl16intergenic[CTAA]3F：GTAGAGGCATATTGGG49295R：ATGGAACGAAAGGAAAClecp11rpl16intron[TTTC]3F：AATGACTAGGCCCGAACT53281R：CAAAGGGATATGGATAAATG

Marker-L和Marker-H分別表示20和1 000 bp標準峰，Product為產物峰Marker-L and Marker-H represent the standard peak of 20 and 1 000 bp， Product represents the peak of product size圖1 引物Clecp3擴增野生樣本8(A)和栽培品種64(B)的產物毛細管電泳結果Fig.1 Product sizes of primer Clecp3 from sample 8 and 64 tested by capillary electrophoresis

表4鐵線蓮11對cpSSR引物的遺傳多樣性參數

Table4Genetic diversity of 11 pairs of cpSSR primers ofC.fuscavar.coreana

標記位點主等位基因頻率觀測等位基因數等位基因數多態信息含量LocusMAFNaNePICClecp102909900004748807589Clecp202909700004521707455Clecp3021821500008333308808Clecp4041821800004403207752Clecp5029091100005411407991Clecp6030911000005591508035Clecp702727900005873808157Clecp8023641300006237108296Clecp904364900003923507235Clecp1003273900004646707615Clecp11027271000005675408125均值Mean030581090915397007914

虛線處為Nei’s遺傳距離0.886 5Nei’s genetic distance of 0.886 5 was marked by dotted line圖2 基于UPGMA法構建的55個樣本聚類樹Fig.2 Cluster tree of 55 samples based on UPGMA algorithm

3 討論

3.1 cpSSR引物的開發

葉綠體基因組保守性強，具有細胞質遺傳的特點，除少數植物外，一般為單親遺傳。遺傳物質由親代向子代傳遞過程中不發生基因重組，不會受到選擇壓力，由于突變等因素產生的變異也因此更容易保存。葉綠體基因組具有獨立的進化路線，因此，cpSSR技術在進行植物分類、群體遺傳結構及物種演化等研究中優勢顯著。cpSSR標記應用的難點在于需要進行引物設計和篩選，通過構件基因組文庫的方法耗時耗力，效率較低。數據庫搜索法則是利用已知的核酸序列，搜索SSR位點進行引物設計和驗證。目前，GeneBank數據庫中存儲有大量高等植物葉綠體基因組全部或部分序列[21-23]，在此基礎上進行葉綠體微衛星標記開發，較文庫構建等方法更為經濟、高效。

3.2 cpSSR的重復基元類型

C.fuscavar.coreana的葉綠體微衛星以單堿基低重復基元為主，且A和T占比較高，與水稻、黃瓜、擬南芥等多種植物[24-27]相似，這種以單堿基重復為主、低豐度的分布特點可能與葉綠體基因組自身特性和進化方向有關。此外，二堿基和三堿基微衛星分別出現了3和4個，與其他高等植物相比，含量偏低[28]。

3.3 引物通用性與多態性

葉綠體基因組序列十分保守，其進化速率僅為核基因組的1/5[29]，這使得cpSSR標記可在近源物種通用[30]。本研究篩選的11對cpSSR引物在鐵線蓮11個(100%)野生種和9個(60%)栽培品種中均可獲得擴增產物，有效等位基因數均值為5.40，顯示了其在鐵線蓮不同種間良好的通用性。微衛星序列多態性的產生源于重復基元數目的改變，與堿基的插入或缺失有關，多態信息含量PIC可以顯示SSR序列的變異程度[31]。11對引物在55個樣本中檢測到的PIC平均值較高，達到0.791 4，所得PCR擴增條帶均大于預計目標條帶，表明此11個位點均存在由堿基插入所致的微衛星長度變異。

3.4 聚類分析

用于本研究的46個鐵線蓮野生種類樣本源于浙江和安徽省，通過植物志信息核對和專家鑒定的方式進行種類確認。15個栽培品種由波蘭進口，通過將觀測到的植株花、葉形態信息在國際鐵線蓮協會(International Clematis Society，http://www.clematisinternational.com/)的數據庫逐一核對進行品種身份確認。Upmga聚類分析發現，絕大多數野生種類、栽培品種聚集在不同的組，表明其遺傳背景存在顯著差異。鐵線蓮不同野生種分別聚類，其中單葉鐵線蓮的3個樣本自成1組，女萎、短尾鐵線蓮和山木通、柱果鐵線蓮分別聚集成2個組，顯示了較近的親緣關系。但蔣明等[18]利用ITS序列所得聚類結果中，女萎與毛蕊鐵線蓮聚為1組，山木通與柱果鐵線蓮則分屬于2個組，這表明不同的分子標記方法和所檢測種類總數可能會對研究結果產生影響。

圓錐鐵線蓮(1個樣本)、安徽鐵線蓮(1個樣本)、大花威靈仙(1個樣本)、天臺鐵線蓮(1個樣本)和毛蕊鐵線蓮(2個樣本)聚集為第Ⅳ組，而毛萼鐵線蓮(2個樣本)則同栽培品種聚集于1組，這可能是由于供試樣本少，導致聚類圖分辨率較低所致，并不能準確顯示不同種類之間的遺傳差異，可通過增加檢測樣本數量進一步驗證。鐵線蓮栽培品種育種多采用雜交獲取，多代雜交與回交、F1代間再次雜交的情況并不鮮見，遺傳信息的交換與重組比較復雜，親緣關系遠近不一。本研究中，仙女座等6個品種沒有獲得目標PCR產物，其育種過程信息在國際鐵線蓮協會數據庫中并無記錄，遺傳背景暫無法確認。此外，葉綠體SSR具有單親遺傳特性，這為評判雜交后代與母本的親緣關系提供了有效工具，但同時也對遺傳背景不明的雜交后代親緣關系評價造成了局限。本次參試的樣本中不包括雜交親本與子代或馴化栽培品種與原種，有關11對cpSSR引物在鐵線蓮栽培品種雜交親本與子代中應用的有效性有待進一步研究。

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DevelopmentandgeneticanalysisofnovelchloroplastmicrosatellitemarkersofClematis

CHEN Wenchao， SU Wanhan， LIU Zhigao*， JI Mengcheng

(CollegeofLandscapeArchitecture，ZhejiangA&FUniversity，Lin’an311300，China)

The whole chloroplast genome sequence ofClematisfuscavar.coreanafrom GeneBank database was analyzed， and 11 cpSSR primer pairs were designed based on that. In addition， the transferability of the 11 pairs of cpSSR primer in different species and cultivars ofClematiswere studied. The results showed that 67 cpSSRs were distributed across the whole chloroplast genome， and most of them located in the area 1 088-41 445 bp and 50 135-127 217 bp， which generally consisted of a single base A/T. All of the 11 pairs of cpSSR primer could be successfully cross-amplified in different species and cultivars ofClematis， which indicated that the 11 primer pairs for cpSSR markers had good transferability inClematis. The average number of alleles (Na) was 10.91， effective number of alleles (Ne) was 5.40， major allele frequency (MAF) was 0.31， and polymorphism information content (PIC) was 0.79. In addition， clustering result of UPGMA of 55 samples based on cpSSR data was discussed.

Clematis; cpSSR; primer development; allele

浙江農業學報ActaAgriculturaeZhejiangensis， 2017，29(12): 2023-2031

http://www.zjnyxb.cn

陳文超， 蘇琬涵， 劉志高， 等. 鐵線蓮屬植物葉綠體微衛星引物開發及其遺傳分析[J]. 浙江農業學報， 2017， 29(12): 2023-2031.

10.3969/j.issn.1004-1524.2017.12.10

2017-05-12

浙江省農業(林木)新品種選育重大科技專項子課題(2016C02056-13-4)；浙江農林大學學生科研訓練項目(104-2013200015)

陳文超(1995—)，男，浙江杭州人，園林專業本科生。E-mail: 80576133@qq.com

*通信作者，劉志高，E-mail: vzhigao@sina.com

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1004-1524(2017)12-2023-09

(責任編輯侯春曉)