白背飛虱酵母雙雜交cDNA文庫的構建

薛 進，李 靜，羊 健，唐 彥，梁 瑤，陳劍平，*，張恒木，*

(1.植物病蟲害生物學與防控湖南省重點實驗室 湖南農業大學 植物保護學院 病毒研究所，湖南 長沙 410128； 2.浙江省農業科學院 病毒學與生物技術研究所，浙江 杭州310021； 3.湖南農業大學 東方科技學院，湖南 長沙 410128)

白背飛虱酵母雙雜交cDNA文庫的構建

薛 進1，2，李 靜2，羊 健2，唐 彥1，3，梁 瑤1，陳劍平2，*，張恒木2，*

(1.植物病蟲害生物學與防控湖南省重點實驗室 湖南農業大學 植物保護學院 病毒研究所，湖南 長沙 410128； 2.浙江省農業科學院 病毒學與生物技術研究所，浙江 杭州310021； 3.湖南農業大學 東方科技學院，湖南 長沙 410128)

白背飛虱(SogatellafurciferaHorvth)作為一種遷飛性害蟲，不僅自身危害水稻，而且以持久性方式傳播南方水稻黑條矮縮病毒(Southernriceblack-streakeddwarfvirus，SRBSDV)。為了研究白背飛虱與SRBSDV之間的相互作用，需要構建一個高質量的酵母篩選文庫，試驗利用Gateway技術構建了白背飛虱cDNA酵母表達文庫，檢測分析顯示，白背飛虱初級文庫庫容量約為1.72×107CFU，cDNA插入片段主要分布在500～2 000 bp，重組率約為95.8%；次級文庫庫容量約為1.73×107CFU，cDNA插入片段主要分布在400～2 000 bp，重組率為100%；Y187酵母菌株的白背飛虱酵母雙雜交cDNA文庫庫容量約5.09×107CFU，插入片段大小在750～2 000 bp，重組率100%，再隨機挑選36個單克隆進行測序分析，所得結果與GenBank數據庫比對顯示36個克隆中含有22個不同的基因，長度在750～2 000 bp，這些分析表明，該文庫可以用于酵母雙雜交的后續篩選，為研究白背飛虱與SRBSDV之間的互作奠定了基礎。

白背飛虱；南方水稻黑條矮縮病毒(SRBSDV)；Gateway技術；酵母雙雜交；cDNA文庫

廣泛分布在東亞地區的為害水稻的白背飛虱(SogatellafurciferaHorvth)屬于半翅目(Hemiptera)同翅亞目飛虱科(Delphacidae)的遷飛性昆蟲[1-3]，是最常見的3種稻飛虱之一，每年春天隨大氣環流方向從中南半島、東南亞和我國的海南島等地不斷地北上遷飛，直至我國東北，其初始遷入量與每年春夏暖濕氣流北上程度相關[4-5]，在南嶺以北地區不能越冬。水稻是其最適宜的寄主，其他寄主只能勉強完成一個世代[6-7]。白背飛虱可通過口針汲取韌皮部汁液直接為害水稻，另外還可以持久方式傳播南方水稻黑條矮縮病毒(Southernriceblack-streakeddwarfvirus，SRBSDV)，且白背飛虱一旦獲毒，將終生攜毒和傳毒，但不經卵垂直傳播[8]。在熱帶氣候地區如海南、福建、廣西等地區，白背飛虱以卵在禾谷類作物或雜草上越冬，第二年春天孵化的若蟲可先在禾本科植物上取食繁殖，然后侵害農作物，并向北方遷移，成為初始蟲源，同時帶毒的白背飛虱成為SRBSDV的初始毒源。之前，我們測定并比較分析了多個中國和越南SRBSDV分離物基因組全序列[9-12]，構建了SRBSDV基因的酵母表達文庫，探討分析了SRBSDV部分基因之間的互作[13-15]。SRBSDV能特異性地在白背飛虱體內增殖并由其高效傳播，反映二者基因之間存在廣泛互作和適應性進化，但當前這方面的研究仍然很缺乏。研究昆蟲基因功能通常要采用cDNA文庫[16-20]，為了利用酵母雙雜交技術探索白背飛虱部分基因功能以及SRBSDV蛋白與白背飛虱間可能存在的互作關系，需要構建一個高質量的酵母篩選文庫，在此前的工作中我們已經構建了SRBSDV越南分離物的誘餌文庫，在這里需構建白背飛虱的cDNA文庫作為靶標文庫。但由于白背飛虱cDNA文庫中包含的目的基因大都是未知的，因而不能采用傳統的文庫構建方法，因而采用了Gateway技術構建白背飛虱cDNA文庫。

Gateway技術就是利用λ噬菌體的位點特異性重組系統[21]的特異性重組特性，借由λ噬菌體整合酶和整合宿主因子的催化作用，將兩端含有重組位點的基因片段構建到含有相應重組位點的載體上，該技術可以同時將DNA序列構建到各種兼容的載體上。與傳統的文庫構建方法相比，Gateway技術構建重組載體時使用attBl和attB2接頭進行位點特異性重組，能夠定向重組進載體，而且無需進行PCR、限制性酶切、連接等過程，簡單快捷；使用毒性基因ccdB篩選陽性克隆，因而陽性克隆率較高，重組成功載體上的ccdB基因被cDNA置換，重組產物轉化到合適的宿主中后只有含重組子的菌株可以成活[22]；同時加入3個不同的閱讀框接頭，使插入的基因片段能夠包含3種不同的讀碼方式，從而確保了文庫的完整性和可靠性。在RT-PCR中獲得的cDNA兩端接上接頭5’-attBl及3’-attB2，它們在酶的催化下與含有attP1、attP2的入門載體pDONR222發生BP重組反應，cDNA位點特異性重組到pDONR222載體上，此時重組載體上的cDNA兩邊是attL1和attL2，在酶的作用下與含有attR1和attR2的酵母表達載體pGADT7-DEST發生LR重組反應，文庫cDNA重組到pGADT7-DEST載體上得到相應的cDNA文庫質粒重組子。肖冬來等[23]利用該技術完成了灰飛虱酵母雙雜交cDNA文庫的構建及分析，結果比較令人滿意。本試驗利用Gateway技術構建了白背飛虱cDNA酵母表達文庫，旨在研究白背飛虱與SRBSDV之間的相互作用。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 白背飛虱

本試驗所用的白背飛虱為實驗室飼養種群，采用健康水稻飼養，用白背飛虱的卵、若蟲、成蟲等各個蟲態的混合樣品提取總RNA。

1.1.2 載體與菌株

載體構建時用到的入門載體為pDNOR222，其通用引物正向為M13F(5’-GTAAAACGACGGCCAG-3’)，反向為M13R(5’-CAGGAAACAGCTATGAC-3’)；酵母表達載體為pGADT7-DEST，其通用引物正向為T7(5’-TAATACGACTCACTATAG GGC-3’)，反向為3-AD(5’-AGATGGTGCACGATGCACAG-3’)；大腸埃希菌菌株DH10B，酵母菌株Y187。

1.1.3 attB1構庫接頭

根據構庫需要而設計的構庫流程，在合成cDNA第二鏈后需在cDNA兩頭連接上aTTB1接頭，在此試驗中用到3種attB1接頭，分別是：

Reading Frame α 5’-TCGTCGGGGACAACTTTGTACAAAAAAGTTGG-3’，

(RFα)3’-CCCCTGTTGAAACATGTTTTTTCAACCp-5’；

Reading Frame β 5’-TCGTCGGGGACAACTTTGTACAAAAAAGTTGGA-3’ ，

(RFβ)3’-CCCCT GTTGAAACATGTTTTTTCAACCTp-5’；

Reading Frame γ 5’-TCGTCGGGGACAACTTTGTACAA AAAAGTTGGAA-3’，

(RFγ)3’-CCCCTGTTGAAACATGTTTTTTCAACCTTp-5’。

1.2 文庫構建方法

本研究利用Gateway技術構建白背飛虱酵母雙雜交cDNA文庫的大致流程為：提取總 RNA→分離mRNA→合成cDNA第一條鏈→合成cDNA第二條鏈→連接attB1接頭→cDNA分級→BP重組反應將cDNA構建到pDNOR222入門載體→轉化感受態細胞→LB重組反應將cDNA重組到pGADT7-DEST表達載體→轉化感受態細胞→鑒定文庫質量。

1.2.1 Trizol法提取白背飛虱總RNA

總RNA提取主要參照Invitrogen公司說明書，采用Trizol法提取水稻葉片或白背飛虱總RNA， RNase free H2O中溶解，-80 ℃保存。

1.2.2 分離mRNA

參考Invitrogen公司說明書，利用FastTrack?2.0 Kit進行mRNA分離，溶于50 μL DEPC-H2O中，置于-80 ℃冰箱保存。

1.2.3 pDNOR222-cDNA 重組子構建

實驗流程和實驗方法參照CloneMiner說明書(Invitrogen)進行。合成cDNA第一鏈，然后合成cDNA的第二鏈，將合成得到的cDNA與attB1重組接頭進行連接。

連接完成后分級分離收集cDNA(用Invitrogen公司產品FastTrack? 2.0 Kit分級分離收集cDNA，操作步驟參照其說明書)。所得含接頭的cDNA進行BP重組反應。

BP重組所得產物電擊轉化大腸埃希菌DH10， 取10 μL轉化后的菌液梯度稀釋10倍、100倍、1 000倍后，從中取出50 μL涂布LB(含Kan+，50 mg·mL-1)平板，第2天計數(選擇3個梯度平板中克隆生長清晰，分布均勻的平板準確計數)，剩余培養物加入甘油至終濃度20%保存于-80 ℃冰箱。

白背飛虱cDNA初級文庫文庫質量鑒定，文庫庫容量計算公式：文庫滴度(CFU·mL-1)=平板克隆數×稀釋倍數/涂板體積(mL)；

文庫的總容量(Total CFU)=文庫滴度(CFU·mL-1)×該文庫總體積(mL)；

重組率和插入片段長度鑒定：隨機挑取48個克隆進行菌落PCR鑒定，PCR產物用1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1.2.4 白背飛虱酵母雙雜交cDNA文庫的構建

抽提初級cDNA文庫的質粒，將抽得的初級文庫質粒用微量濃度測定儀測定濃度，然后用滅菌ddH2O按比例稀釋至300 ng·μL-1。建立LR重組反應將白背飛虱cDNA重組到pGADT7-DEST載體上，參照上述BP重組反應步驟得到重組cDNA。

電轉化大腸埃希菌DH10B，加入2 mL SOC 液體培養基，37 ℃復蘇1 h，轉化液用SOC 液體培養基稀釋10 倍后全部涂于大量的LB 平板(含100 mg·mL-1Amp+)，37 ℃倒置培養過夜，無菌操作刮下菌苔，懸浮于20%甘油保存液中，分裝后-80 ℃保存，此即為次級文庫。取10 μL菌液梯度稀釋10倍、100倍、1 000倍，從中取出50 μL涂布LB(含Amp+，100 mg·mL-1)平板，第2天計數(選擇3個梯度平板中克隆生長清晰，分布均勻的平板準確計數)，用于庫容量鑒定。然后鑒定次級文庫質量，PCR引物使用酵母載體通用引物組合F/R∶5’-T7/3’-AD。

1.2.5 Y187酵母菌株的白背飛虱酵母雙雜交cDNA文庫制備

Y187酵母感受態細胞制備：用醋酸鋰法制備酵母感受態細胞，然后用PEG/LiAc法將白背飛虱酵母雙雜交次級文庫質粒轉化酵母菌株Y187，在SD/-Leu固體平板上，30 ℃倒置培養3～5 d，直至長出克隆；同時取10 μL菌液稀釋10倍、100倍、1 000倍后取100 μL涂布SD/-Leu固體平板用于計算轉化后文庫克隆數。

將長有菌落的SD/-Leu固體平板于4 °C預冷3～4 h，然后用含25%甘油的YPD液體冷卻培養基刮菌，調節菌液濃度至>1×107cell·mL-1，每管1 mL分裝，保存于-80 ℃。

2 結果與分析

2.1 白背飛虱總RNA

RNA質量是文庫構建質量關鍵因素之一，提取白背飛虱總RNA是構建其文庫的第一步，本試驗中采用了Trizol法提取白背飛虱總RNA，mRNA的分離使用了Invitrogen公司產品FastTrack?2.0 Kit。用1.0%瓊脂糖電泳檢測提取的白背飛虱總RNA可以看到清楚的3條帶，即28S、18S 和5S RNA，說明提取的總RNA質量較好，純化的mRNA大小主要集中在750～2 000 bp(圖 1)。

M，DNA ladder; 1，Total RNA; 2，mRNA圖1 白背飛虱總RNA及mRNA電泳Fig.1 Electrophoresis of Sogatella furcifera total RNA

2.2 庫容量鑒定

2.2.1 初級文庫庫容量及檢測

本試驗構建的初級文庫庫容量檢測中，在稀釋1 000倍的平板上生長了86個單克隆(圖 2)，根據庫容量公式計算得出：文庫滴度為1.72×106CFU·mL-1，文庫庫容量為1.72×107CFU，即初級文庫庫容量約為1.72×107CFU。從圖3可以看出，白背飛虱初級文庫cDNA插入片段主要分布在500～2 000 bp，平均插入片段大于1 000 bp，具有良好的多態性。在所檢測的48個轉化子中有2個為空載體，根據公式：文庫重組率=(有插入片段的轉化子/總轉化子)×100%，計算出文庫的重組率約為95.8%，所以插入片段長度和重組率均符合文庫構建要求。

稀釋倍數1∶1 000；涂布量50 μL；單克隆數86Dilution factor was 1∶1 000; Coating weight was 50 μL; Number of clones was 86圖2 初級文庫庫容量檢測Fig.2 Calculation of the primary library titer

M， Marker 10 kb Plus DNA ladder；泳道1～24為擴增產物M， Trans10K DNA ladder; Lane 1-24， Amplification products by PCR圖3 初級文庫PCR檢測Fig.3 Detection of primary library by PCR

2.2.2 次級文庫庫容量及檢測

本試驗構建的初級文庫庫容量檢測中，在稀釋100倍的平板上生長了867個單克隆(圖4)，根據庫容量公式計算得出:文庫滴度為1.73×106CFU·mL-1，文庫庫容量為1.73×107CFU，即次級文庫庫容量約為1.73×107CFU。從圖5可以看出，白背飛虱次級文庫cDNA 插入片段主要分布在400～2 000 bp，平均插入片段大于900 bp，具有良好的多態性。在所檢測的24個轉化子中沒有空載體，因而次級文庫的重組率為100%，所以插入片段長度和重組率均符合文庫構建要求。

2.2.3 Y187酵母菌株的白背飛虱酵母雙雜交cDNA文庫庫容量及檢測

一個合格的cDNA文庫其庫容量要求達到1×106CFU以上，本試驗構建的Y187酵母菌株白背飛虱酵母雙雜交cDNA文庫庫容量檢測中，在稀釋1 000倍的平板上生長了509個單克隆(圖6)，根據庫容量公式計算得出：文庫滴度為5.09×106CFU·mL-1，文庫庫容量為5.09×107CFU，即白背飛虱酵母雙雜交文庫庫容量約為5.09×107CFU，符合酵母文庫篩選試驗的要求。

稀釋倍數1∶100；涂布量50 μL；單克隆數867Dilution factor was 1∶100; Coating volumn was 50 μL; Number of clones was 867圖4 酵母文庫庫容量檢測Fig.4 Calculation of the secondary library titer

M， Marker 10 kb Plus DNA ladder; 泳道1～24為部分文庫cDNA擴增產物M， Trans10K DNA ladder; Lane 1-24， Amplification products by PCR圖5 次級文庫PCR檢測Fig.5 Detection of secondary library by PCR

稀釋倍數1∶1 000；涂布量100 μL；單克隆數509Dilution factor was 1∶1 000; Coating volumn was 100 μL; Number of clones was 509圖6 Y187酵母文庫庫容量檢測Fig.6 Calculation of the Y187 cDNA library titer

隨機挑選72個單克隆分別用通用引物進行PCR分析，結果顯示72個克隆均含有重組片段，重組率100%，達到文庫構建要求，插入片段的大小平均約1 000 bp(圖 7)。再隨機挑選36個單克隆進行測序分析，測序所得結果用BLAST對比分析，結果表明36個克隆中含有22個不同的基因(表1)，長度在750～2 000 bp，這些分析表明該文庫可以用于酵母雙雜交的后續篩選。

M， Marker 10 kb Plus DNA ladder; 泳道1～12為部分文庫cDNA擴增產物M， Trans10K DNA ladder; Lane 1-12， Amplification products of cDNA clones by PCR圖7 Y187酵母cDNA文庫PCR檢測Fig.7 Detection of Y187 cDNA library by PCR

表1二十二個基因測序分析結果

Table1The results of sequencing and analysis of 22 genes

編號No．同源基因序列號SerialnumberofHomologousgeneE值Evalue基因注釋Geneannotation1HM60072310LaodelphaxstriatellusstrainYunnancloneLsCarE1carboxylesterase(LsCarE)2HM16012210Sogatellafurciferaisolatebb4cytochromeoxidasesubunitIgene3HM23375210Sogatellafurciferaisolate4116SribosomalRNAgene，partialsequence；mitochondrial4HF95118411e?83PantroglodytesBACcloneRP43?86L11fromchromosome75LT72725710001Xenopus(Silurana)tropicalisG?2andS?phaseexpressed1(gtse4)，mRNA6FJ36069510Laodelphaxstriatellusmitochondrion，completegenome7KX67054410Laodelphaxstriatellusputativemucin?likeproteinmRNA，completecds8XM＿01526911819e?75ChrysomelatremulaeribosomalproteinL21(RpL22)mRNA，complete9BT05849812e?12Arabidopsisthalianachromosome0，completesequence10KC51291510SogatellafurciferaisolateWBPHYNmitochondrion，completegenome11KX24592710Sogatellafurcifera16SribosomalRNAgene，partialsequence；mitochondrial12HM23374012e?130Arcofaciesmaculatipennisisolate816SribosomalRNAgene，partialsequence；mitochondrial13AY16696918e?179Oryzasativa(indicacultivar?group)resistance?relatednon?codingRNA(nc1)，completesequence14XM＿01526911819e?75PREDICTED：Diachasmaalloeum60SribosomalproteinL21(LOC107046495)，mRNA15HM23380012e?179Sardiarostrataisolate23416SribosomalRNAgene，partialsequence；mitochondrial16KX24596810Matutinusmelichari16SribosomalRNAgene，partialsequence；mitochondrial17JX88006818e?179Laodelphaxstriatellusmitochondrion，completegenome18HM23375015e?156Nilaparvatamuiriisolate2716SribosomalRNAgene，partialsequence；mitochondrial19KX24594111e?162Himeunkatateyamaella16SribosomalRNAgene，partialsequence；mitochondrial20HM23376210Matutinusmelichariisolate6916SribosomalRNAgene，partialsequence；mitochondrial21KX24595512e?179Sardiarostrata16SribosomalRNAgene，partialsequence；mitochondrial22XM00113654220Unknown1

3 討論

本試驗構建了白背飛虱酵母雙雜交cDNA文庫。首先在總RNA提取中，電泳檢測提取的白背飛虱總RNA可以看到清楚的28S、18S 和5S RNA條帶，說明提取的總RNA質量較好，純化的mRNA大小也主要集中在750～2 000 bp，完全滿足了下游操作需要。在逆轉錄合成了雙鏈cDNA后，巧妙地利用了Gateway技術中λ噬菌體的位點特異性重組系統，借由λ噬菌體整合酶和整合宿主因子的催化作用，將兩端含有重組位點的基因片段構建到含有相應重組位點的載體上，這樣充分地將cDNA中的未知基因連接到載體上，避免了需要設計特異引物進行特異性擴增，也保證所插入cDNA 片段的完整性，在對文庫質量及庫容量的檢測中充分體現了這些優點，重組率和插入片段長度均符合文庫構建的要求。當然，由于白背飛虱總RNA提取中沒有去掉飛虱腸道中的取食物，可能會殘留部分水稻等食物，構建的文庫質粒中也許含有水稻等物種的其他基因，但在后期的篩選中可以通過測序等手段去除這些干擾。

目前，國內外曾報道過用各種不同方法構建白背飛虱[24]、灰飛虱(Laodelphaxstriatellus)[25]和褐飛虱(Nilaparvatalugens)[26]的酵母雙雜交cDNA文庫，用于研究昆蟲基因功能、介體昆蟲與植物病毒的互作[15，27]。本試驗中利用Gateway技術構建了白背飛虱酵母雙雜交cDNA文庫，并對該文庫進行了質量鑒定，結果顯示白背飛虱cDNA初級文庫庫容量約為5.16×107CFU，次級文庫庫容量約為1.73×107CFU，白背飛虱酵母雙雜交cDNA文庫庫容量約為5.09×107CFU，重組率和庫容量均達到了文庫構建要求，插入片段位于400～2 000 bp。在對含有的基因含量進行檢測中發現基因豐富度較高，基本符合預期目標，說明此方法是方便快捷可行的，達到酵母文庫篩選所要求的文庫質量標準，可用于與已轉入Y2H Gold菌株中的SRBSDV文庫進行Mating雜交，篩選互作蛋白等工作。

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Constructionofyeasttwo-hybridcDNAlibraryofwhite-backedplanthopper(Sogatellafurcifera)

XUE Jin1，2， LI Jing2， YANG Jian2， TANG Yan1，3， LIANG Yao1， CHEN Jianping2，*， ZHANG Hengmu2，*

(1.HunanProvincialKeyLaboratoryforBiologyandControlofPlantDiseasesandInsectPests，InstituteofVirology，CollegeofPlantProtection，HunanAgriculturalUniversity，Changsha410128，China; 2.InstituteofVirologyandBiotechnology，ZhejiangAcademyofAgriculturalSciences，Hangzhou310021，China; 3.CollegeofOrientScience&Technology，HunanAgriculturalUniversity，Changsha410128，China)

White-backed planthopper (SogatellafurciferaHorvth) is a major migratory pest that feed on rice plants and transmitSouthernriceblack-streakeddwarfvirus(SRBSDV) in a persistent manner. In order to screen interactions between the genes of WBPH and SRBSDV， a cDNA expression library of WBPH was firstly constructed into the yeast plasmids using Gateway technique in this study. The results showed that the primary library consisted of 1.72×107CFU (colony-forming units)， the sizes of most inserts were 500-1 500 bp in length， and the recombinant frequency was about 95.8%; the titer of secondary cDNA library was 1.73×107CFU， the sizes of most inserts were 400-2 000 bp in length， and the recombinant frequency was 100%; the titer assays showed that the cDNA library was approximately 5.09×107CFU for yeast two-hybrid cDNA library of Y187; PCR assays showed that the average length of insertions were 750-2 000 bp and the recombinant frequency of the cDNA library was high up to 100%， random sequence analysis of 36 clones showed that 22 of the clones were different in GenBank. These results consistently indicated that the cDNA library could be used for screening interactions in the yeast two hybrid experiments， which laid the foundation for studying on the interactions between white-backed planthopper and SRBSDV.

white-backed planthopper (SogatellafurciferaHorvth);Southernriceblack-streakeddwarfvirus(SRBSDV); Gateway technique; yeast two-hybrid; cDNA library

浙江農業學報ActaAgriculturaeZhejiangensis， 2017，29(12): 2060-2067

http://www.zjnyxb.cn

薛進，李靜，羊健，等. 白背飛虱酵母雙雜交cDNA文庫的構建[J].浙江農業學報，2017，29(12)： 2060-2067.

10.3969/j.issn.1004-1524.2017.12.14

2017-05-09

湖南省教育廳科學研究項目(16C0773)

薛進(1980—)，男，湖南桃江人，博士，講師，主要從事昆蟲病毒學研究。E-mail: xuejin@hunau.edu.cn

*通信作者，陳劍平，E-mail: jpchen2001@126.com；張恒木，E-mail: zhhengmu@tsinghua.org.cn

S435.11

A

1004-1524(2017)12-2060-08

(責任編輯張 韻)