堆肥方式和溫度對(duì)牛糞堆肥過(guò)程中天然類固醇激素降解的影響

王代懿，余 洋，張豐松，李性苑，茍?bào)w忠

(1.凱里學(xué)院 植物資源綜合利用研究所，貴州 凱里 556011； 2.中國(guó)地質(zhì)環(huán)境監(jiān)測(cè)院，北京 100081； 3.中國(guó)科學(xué)院 地理科學(xué)與資源研究所，北京100101)

堆肥方式和溫度對(duì)牛糞堆肥過(guò)程中天然類固醇激素降解的影響

王代懿1，余 洋2，張豐松3，*，李性苑1，茍?bào)w忠1

(1.凱里學(xué)院 植物資源綜合利用研究所，貴州 凱里 556011； 2.中國(guó)地質(zhì)環(huán)境監(jiān)測(cè)院，北京 100081； 3.中國(guó)科學(xué)院 地理科學(xué)與資源研究所，北京100101)

為了實(shí)現(xiàn)畜禽糞便的無(wú)害化處理及資源化利用，以新鮮牛糞和木屑作為堆料，采用微型試管堆肥法，模擬研究了好氧和厭氧2種堆肥方式下不同堆肥溫度(38、50、70 ℃)對(duì)黃體酮、雄烯二酮、17β-雌二醇、雌酮4種天然類固醇激素降解的影響。結(jié)果表明，不同溫度條件下4種激素在2種堆肥方式下的去除率介于67.6%～100%，其中50 ℃下的去除率為81.9%～100%。4種激素中，雌酮和雄烯二酮在好氧堆肥方式下的去除率優(yōu)于厭氧堆肥。試驗(yàn)溫度(38～70 ℃)對(duì)17β-雌二醇、黃體酮和雄烯二酮在牛糞堆肥中的降解影響很小，而在70 ℃的高溫堆肥條件下，雌酮的降解受到抑制。在保證堆肥腐熟、殺死有害微生物的前提下，50 ℃下好氧堆肥效果最佳。

天然類固醇激素；堆肥；降解

天然類固醇激素化合物是一類廣泛存在于環(huán)境中的內(nèi)分泌干擾物(endocrine disrupting chemicals，EDCs)，包括孕激素、雄激素、雌激素和腎上腺皮質(zhì)激素，在動(dòng)物和人體內(nèi)合成，主要通過(guò)生物體以排泄的方式進(jìn)入環(huán)境。天然類固醇激素化合物有著極強(qiáng)的內(nèi)分泌干擾作用，在極低的環(huán)境濃度(0.1 ng·L-1)下就可能對(duì)生物體造成危害[1-2]。

天然類固醇激素主要通過(guò)動(dòng)物糞便排放，經(jīng)由養(yǎng)殖廢水[3]、環(huán)境污水[4]、糞便農(nóng)用[5]等各種方式進(jìn)入土壤及水體。在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，畜禽糞便一直被作為安全高效的有機(jī)肥廣泛應(yīng)用。糞便農(nóng)用可導(dǎo)致天然類固醇激素對(duì)土壤的污染，并流失進(jìn)入地表水和地下水[6-7]。農(nóng)民在蔬菜、瓜果與有機(jī)食品生產(chǎn)中盲目大量地施用有機(jī)肥，由此引發(fā)的農(nóng)村面源污染問(wèn)題已逐漸提上議事日程。一些學(xué)者指出，畜禽糞便農(nóng)用已成為環(huán)境中天然類固醇激素的主要來(lái)源[8-10]。目前，國(guó)內(nèi)外畜禽糞便的處置方式主要還停留在氮、磷、重金屬等常規(guī)污染防治和臭氣去除方面，重點(diǎn)發(fā)展趨勢(shì)主要集中在資源化，而對(duì)于排放的絕大多數(shù)天然類固醇激素類內(nèi)分泌干擾物的防治還依然處于起步階段，有關(guān)畜禽糞便中天然類固醇激素去除方面的研究鮮見(jiàn)報(bào)道。對(duì)于畜禽糞便的源頭處理，目前比較適合我國(guó)國(guó)情的主流處理方法為堆肥法。為此，本文特選擇黃體酮(孕激素)、雄烯二酮(雄激素)、17β-雌二醇和雌酮(雌激素)4種典型天然類固醇激素為研究對(duì)象，探索不同堆肥溫度在好氧和厭氧條件下對(duì)堆肥過(guò)程中天然類固醇激素降解的影響，以期為我國(guó)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中天然類固醇激素的污染風(fēng)險(xiǎn)防控提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)準(zhǔn)品及堆肥原料

黃體酮(PGT)、雄烯二酮(ADD)、17β-雌二醇(17β-E2)和雌酮(E1)均購(gòu)于美國(guó)Sigma公司，純度為99.9%。堆肥原料是新鮮牛糞，采集于北京郊區(qū)某奶牛場(chǎng)。樣品先冷凍干燥，研磨后，過(guò)2 mm篩，待用。選用木屑作為牛糞堆肥的調(diào)理劑。牛糞的pH值為7.6，電導(dǎo)率(EC)為6.45 mS·cm-1，總氮(TN)含量1.98%，總碳(TC)含量30.27%，含水量45.1%；木屑的TN、TC含量分別為0.17%和45.98%，含水量5.6%。

1.2 堆肥參數(shù)及培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)

堆肥試驗(yàn)采用微型試管堆肥法。堆肥原料(牛糞)和調(diào)理劑(木屑)按比例充分混合，獲得堆體初始碳氮比(C/N)為30。在堆體中加入去離子水，控制初始含水量為60%。同時(shí)，去離子水中分別添加天然類固醇激素標(biāo)準(zhǔn)品(PGT、ADD、17β-E2和E1)，使得堆體中各激素的初始濃度達(dá)到2 mg·kg-1(以干質(zhì)量計(jì))。準(zhǔn)確稱取5 g堆肥樣品于50 mL試管中，分別模擬好氧和厭氧2種堆肥條件。好氧條件下的離心管使用紗布封口，期間每天稱重補(bǔ)水；厭氧條件下的離心管中充分通入氮?dú)猓褂迷嚬苌w密封。設(shè)置3組溫度(38、50、70 ℃)，將樣品分別置于相應(yīng)條件下的氣候培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d。培養(yǎng)后第7天取樣，測(cè)定各處理堆肥樣品中目標(biāo)激素殘留量，每種處理均設(shè)置3個(gè)重復(fù)。

1.3 天然類固醇激素分析測(cè)定

精確稱取1.00 g堆肥樣品于50 mL聚丙烯刻度離心管中，加入40 μL中間混標(biāo)儲(chǔ)備液作為內(nèi)標(biāo)(氘代物內(nèi)標(biāo)的標(biāo)準(zhǔn)品以甲醇為溶劑，分別配制成200 μg·mL-1的單標(biāo)儲(chǔ)備液，再把各單標(biāo)儲(chǔ)備液配制成各目標(biāo)物濃度分別為1 μg·mL-1的中間混標(biāo)儲(chǔ)備液)，再加入20 mL甲醇，渦旋振蕩后，超聲提取20 min。混合液在12 000 r·min-1高速離心5 min后，取出上清液，重新加入20 mL甲醇，重復(fù)2次。合并3次上清液，加入15 mL蒸餾水，再加入30 mL正己烷，棄去上層油脂層，重復(fù)1次。40 ℃下水浴旋蒸至約10 mL，加入100 mL蒸餾水稀釋。

取上步液體于250 mL錐形瓶中，加入10 mL二氯甲烷，充分振蕩，混合均勻，靜置分層后超聲，取下層溶液至250 mL茄形瓶中。重新加入10 mL二氯甲烷，重復(fù)2次，合并3次萃取液。40 ℃水浴下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至近干，加入10 mL甲醇溶解，再加入100 mL蒸餾水稀釋。

選用HLB柱(規(guī)格為6 mL/500 mg)，6 mL乙酸乙酯、6 mL乙腈、12 mL水活化。將上步水溶液上樣，流速5 mL·min-1。10 mL水、5 mL 50%甲醇水溶液清洗，之后通過(guò)真空泵高負(fù)壓抽干30 min。15 mL乙酸乙酯和6 mL乙酸乙酯-乙腈(體積比1∶1)洗脫。將洗脫液收集至40 mL棕色螺旋口存儲(chǔ)瓶，氮吹至干，加入2 mL甲醇-乙酸乙酯(體積比4∶6)溶解。

選用NH2柱(規(guī)格為3 mL/500 mg)，4 mL甲醇-乙酸乙酯(體積比4∶6)、4 mL水飽和乙酸乙酯活化。將上一步溶解樣品上樣，自然流速，2 mL甲醇-乙酸乙酯(體積比4∶6)清洗。收集上樣溶液和清洗溶液至10 mL尖頭試管，氮吹至干。0.2 mL乙酸乙酯渦旋振蕩，超聲溶解10 s，加入1.8 mL正己烷，混合均勻。

選用Silica柱(規(guī)格為3 mL/500 mg)，4 mL水飽和乙酸乙酯、4 mL正己烷-乙酸乙酯(體積比9∶1)活化。將上一步溶解樣品上樣，自然流速。3 mL正己烷-乙酸乙酯(體積比9∶1)清洗，然后加入6 mL水飽和乙酸乙酯洗脫，洗脫液收集至10 mL尖頭試管，氮吹至干，再加入0.5 mL 40%乙腈-0.1%乙酸水溶液，超聲溶解10 s，轉(zhuǎn)移至2 mL進(jìn)樣小瓶的內(nèi)襯管中。

基于液相色譜串聯(lián)雙質(zhì)譜聯(lián)用(LC-MS/MS)測(cè)定堆肥樣品中PGT、ADD、17β-E2和E1的濃度，具體地：0—2 min，用80%的0.1%乙酸(A)和20%的乙腈(B)洗脫，模式為CUR，正負(fù)離子分別為30、30；2—6 min，用80%的0.1%乙酸和20%的乙腈洗脫，模式為Gas1，正負(fù)離子分別為80、80；6—15 min，用60%的0.1%乙酸和40%的乙腈洗脫，模式為Gas2，正負(fù)離子分別為70、70；15—20 min，用60%的0.1%乙酸和40%的乙腈洗脫，模式為IS，正負(fù)離子分別為5 500、-4 500；20—25 min，用20%的0.1%乙酸和80%的乙腈洗脫，模式為CAD，正負(fù)離子分別為3、3；25 min，用80%的0.1%乙酸和20%的乙腈洗脫，模式為TEM，正負(fù)離子分別為550、550。

在堆肥原料中加入去離子水，控制初始含水量為60%，同時(shí)，水中添加天然類固醇激素標(biāo)準(zhǔn)品(PGT、ADD、17β-E2、E1)，使得堆體中各激素初始濃度達(dá)到50 ng·g-1(以干質(zhì)量計(jì))。隨后按上述分析測(cè)定方法進(jìn)行回收試驗(yàn)。結(jié)果表明，該方法堆肥樣品中目標(biāo)激素的最低檢測(cè)限為0.32～16 ng·g-1，4種激素的回收率平均值分別為108.9%、100.9%、119.5%和95.5%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為10.6%、9.4%、12.0%和8.5%，適合環(huán)境樣品分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 堆肥方式的影響

本研究堆肥試驗(yàn)分別在好氧和厭氧2種條件下進(jìn)行，堆肥溫度50 ℃，4種天然類固醇激素在牛糞堆肥中的降解結(jié)果見(jiàn)圖1。相對(duì)于初始濃度2 mg·kg-1，4種天然類固醇激素在厭氧和好氧堆肥條件下的去除率介于81.9%～100%。其中，17β-E2在2種方式下堆肥7 d后，殘留濃度均低于儀器檢測(cè)限，去除率達(dá)100%，PGT在厭氧和好氧堆肥條件下的去除率分別為99.89%和99.83%，并且PGT和17β-E2的去除基本不受氧氣條件的限制。E1和ADD在堆肥過(guò)程中的降解在一定程度上受氧氣條件的影響，E1在厭氧和好氧堆肥條件下的去除率分別為81.9%和98.0%，ADD在厭氧和好氧堆肥條件下的去除率分別為96.6%和100%，兩者在好氧堆肥下的去除效果均明顯優(yōu)于厭氧堆肥。

有研究報(bào)道顯示[11]，在用牛糞、豬糞和雞糞改良的土壤中，E1在牛糞中的降解速率略高于在豬糞和雞糞中，17β-E2在上述3種糞便改良的土壤中降解速率變化不大。由此可以推理，若對(duì)其他類型糞便進(jìn)行堆肥處理，天然類固醇激素也能達(dá)到類似的去除效果。從本試驗(yàn)結(jié)果來(lái)看，堆肥過(guò)程中天然類固醇激素含量大幅降低，4種激素的去除率均達(dá)80%以上，尤其是17β-E2的去除率達(dá)100%。17β-E2被認(rèn)為是普遍存在于各類環(huán)境介質(zhì)中，且生物活性最強(qiáng)的一種雌激素[12]。由此可知，好氧堆肥是現(xiàn)階段去除糞便中天然類固醇激素最經(jīng)濟(jì)有效的方法之一。

圖1 不同堆肥方式下牛糞中天然類固醇激素的殘留濃度Fig.1 Residue concentration of natural hormones in cow dung under different composting manners

2.2 堆肥溫度的影響

試驗(yàn)結(jié)果(圖2)顯示，2種堆肥方式3種堆肥溫度下，4種目標(biāo)激素在堆肥中的去除率介于67.6%～100%，其中，E1的去除率介于67.6%～98.0%，17β-E2在3種溫度下的去除率均為100%，PGT的去除率介于97.2%～99.9%，ADD的去除率介于96.9%～100%。4種激素中，E1在70 ℃高溫下降解率明顯降低，厭氧和好氧條件下去除率分別僅為73.3%和67.6%，其余3種激素的降解在試驗(yàn)溫度范圍內(nèi)(38～70 ℃)基本不受影響。

溫度是影響堆肥系統(tǒng)中微生物活動(dòng)和工藝過(guò)程的重要因素，控制溫度的目的在于為微生物營(yíng)造一個(gè)適合的溫度環(huán)境，以利于其繁殖和降解更多的底物。同時(shí)，堆肥溫度也是殺滅致病菌、去除水分的關(guān)鍵因素。按照美國(guó)環(huán)境保護(hù)署制定的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)[13]，堆體溫度在50 ℃以上保持5～7 d或55 ℃條件下保持3 d以上，是殺滅堆肥原料中所含致病微生物，保證堆肥的衛(wèi)生指標(biāo)合格和堆體腐熟的重要條件。堆肥中高于70 ℃以上的溫度比較罕見(jiàn)，并且對(duì)堆肥不利[14]。因此，本研究選擇38、50、70 ℃作為控制溫度，進(jìn)行好氧和厭氧條件下的堆肥試驗(yàn)。通常，嗜溫菌的最適溫度為30～40 ℃，嗜熱菌的最適溫度為50～60 ℃。在堆肥初期，堆體基本呈中溫，嗜溫菌得到大量繁殖，它們?cè)诶糜袡C(jī)物的過(guò)程中不斷釋放熱量，1～2 d即可以使堆體溫度達(dá)到50～60 ℃。在此溫度下，嗜溫菌大量死亡，嗜熱菌大量繁殖，同時(shí)堆體溫度明顯升高，堆肥發(fā)酵進(jìn)入高溫，并在高溫范圍內(nèi)穩(wěn)定一段時(shí)間，使得堆肥中的寄生蟲(chóng)和病原菌被殺死，腐殖質(zhì)開(kāi)始形成，堆肥達(dá)到初步腐熟[15]。

圖2 不同堆肥溫度下牛糞中E1、17β-E2、PGT和ADD的殘留濃度Fig.2 Residual concentration of E1， 17β-E2， PGT and ADD in cow dung under different composting temperature

本研究中，在好氧和厭氧條件下，38 ℃及50 ℃對(duì)天然類固醇激素的綜合去除效果都較好。綜合考慮對(duì)堆體中致病菌、蟲(chóng)卵、寄生蟲(chóng)、孢子以及雜草種子的殺滅，為保證堆肥的衛(wèi)生指標(biāo)和堆體腐熟，應(yīng)選擇在50℃條件下進(jìn)行好氧堆肥。

3 小結(jié)

本研究表明，當(dāng)堆肥過(guò)度為38～70 ℃，在好氧或厭氧條件下，牛糞中E1、17β-E2、PGT和ADD的去除率介于67.6%～100%，50 ℃的去除率為81.9%～100%。4種激素中，雄烯二酮和雌酮在好氧堆肥方式下的去除率優(yōu)于厭氧堆肥。試驗(yàn)溫度(38～70 ℃)對(duì)17β-雌二醇、黃體酮和雄烯二酮在牛糞堆肥中的降解速率影響很小，而在70 ℃的高溫堆肥條件下，牛糞中雌酮的降解受到抑制。在去除天然類固醇激素的同時(shí)，綜合考慮堆肥的衛(wèi)生指標(biāo)和堆體腐熟，以50 ℃下進(jìn)行好氧堆肥的整體效果最好。

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Effectsofcompostingtemperatureandmannerondegradationofnaturalhormonesduringcattlemanurecomposting

WANG Daiyi1， YU Yang2， ZHANG Fengsong3，*， LI Xingyuan1， GOU Tizhong1

(1.InstituteofComprehensiveUtilizationofPlantResources，KailiUniversity，Kaili556011，China; 2.ChinaInstituteofGeo-EnvironmentMonitoring，Beijing100081，China; 3.InstituteofGeographicSciencesandNaturalResourceResearch，Beijing100101，China)

In order to achieve the innocuous treatment and resource utilization of livestock manure， fresh cow dung and straw were used as pile materials. Four types of hormone (progesterone ， androstenedione， 17β-estradiol and estrone) were incubated in cow dung under different temperature (38， 50， 70 ℃) to study the influence of composting temperature on the degradation rate of 4 hormones under either aerobic or anaerobic composting conditions. It was shown that the degradation rate of 4 hormones ranged from 67.6% to 100% under different temperature， and the degradation rate ranged from 81.9% to 100% at 50 ℃. The degradation rate of estrone and androstenedione were higher under aerobic composting than that under anaerobic composting. The tested temperature (38-70 ℃) had little effect on degradation of 17β-estradiol， progesterone and androstenedione in cow dung. But， the degradation of estrone was inhibited under 70 ℃. Giving compost maturity and removal of disease-causing organisms， aerobic composting under 50 ℃ seemed to be the best option.

natural hormones; composting; degradation

浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)ActaAgriculturaeZhejiangensis， 2017，29(12): 2104-2108

http://www.zjnyxb.cn

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10.3969/j.issn.1004-1524.2017.12.20

2017-06-13

環(huán)保公益性行業(yè)科研專項(xiàng)(201509074)；凱里學(xué)院博士科研專項(xiàng)(BS201505)；貴州省科技廳聯(lián)合基金(黔科合LH字[2015]7752號(hào));分析化學(xué)重點(diǎn)學(xué)科(院通字[2014]157號(hào))

王代懿(1975—)，女，貴州景屏人，博士，研究方向?yàn)樾笄菁S便資源化處理及其污染物環(huán)境行為。E-mail：wangdaiyi234567@163.com

*通信作者，張豐松，E-mail:zhangfs@igsnrr.ac.cn

X53

A

1004-1524(2017)12-2104-05

(責(zé)任編輯高 峻)