烤煙煙葉烘烤中蛋白質的降解動態變化規律研究

王萬能，項鋼燎，翟羽晨，馬擴彥，戴 亞，譚蘭蘭

(1.重慶理工大學 藥學與生物工程學院，重慶 400054；2.重慶中煙工業有限責任公司，重慶 400060；3.四川中煙工業有限責任公司，四川 成都 610000)

烤煙煙葉烘烤中蛋白質的降解動態變化規律研究

王萬能1，項鋼燎1，翟羽晨1，馬擴彥2，戴 亞2，譚蘭蘭3

(1.重慶理工大學 藥學與生物工程學院，重慶 400054；2.重慶中煙工業有限責任公司，重慶 400060；3.四川中煙工業有限責任公司，四川 成都 610000)

為明確不同部位及不同烘烤時間段煙葉中蛋白質變化規律，利用SDS-PAGE電泳等實驗技術，分析煙葉蛋白動態分布和變化特點。煙葉蛋白在不同的烘烤時間段的降解速度不同，在烘烤0～50 h煙葉蛋白質含量的降解速度快，從19%降至9%，烘烤后期趨于平緩。煙葉蛋白分子量分布在11.8～90.5 ku，上、中、下部葉片的蛋白存在明顯差異，上部葉片中大、小分子量蛋白含量比中、下部葉片多，下部葉片中分子量蛋白含量較高。不同類別的蛋白在煙葉烘烤過程的不同階段中降解規律不相同。

煙葉；蛋白質；SDS-PAGE；降解

煙草屬于草本植物中的茄科類，蛋白質在煙草生長發育過程中對其生理生化過程具有重要意義，它在煙草生長發育過程中逐漸積累，采收后新鮮煙葉中的蛋白質在其烘烤調制過程中又逐漸減少[1-4]。品質好的煙葉在烘烤調制、儲存之后其蛋白質多分解為分子量較小的短肽，或分解為氨基酸參與美拉德反應，積累煙葉的功效物質。過量的大分子蛋白質，會影響卷煙的質量，在品吸時會有難聞的焦油氣味，燃燒性能不好，并且成品煙辛辣有毒、味苦澀，降低了煙草的安全性和香味品質[5-11]，而目前對煙葉內蛋白質的變化分布特點了解甚少。本試驗運用SDS-PAGE電泳技術對不同部位和烘烤階段煙葉的蛋白質變化情況進行研究，以準確了解不同部位的煙葉品質和生產用途，為改善煙葉烘烤工藝提升烤煙品質提供依據。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

1.1.1 煙葉樣品

烤煙品種為紅花大金元、K326，煙葉樣品由重慶市武隆縣巷口鎮煙草生產基地提供，取烤煙煙株已成熟的新鮮上、中、下葉位葉片，置于烘箱中于105 ℃殺青30 min，采用重慶市三段六步式烘烤工藝，取烘烤過程中不同烘烤時間段葉片，皆用液氮保存。

1.1.2 實驗藥品

BCA蛋白質定量試劑盒(SIGMA-ALDRICH)、磷酸氫二鈉(AR)、磷酸二氫鈉(AR)、牛血清蛋白質(AR)、TCA(15%三氯乙酸水溶液)、PBS(磷酸緩沖液0.05 mol·L-1，pH 6～8)、SDS(美國Sigma公司)、四甲基乙二胺TEMED(美國AMRESCO公司)、過硫化銨(廣州捷倍斯生物科技有限公司)、Tris(美國AMRESCO公司)。濃HCl、β-巰基乙醇、蔗糖、丙烯酰胺、亞甲基雙丙烯酰胺、甲醇、冰乙酸、考馬斯亮藍R250、Tris酚、醋酸銨、丙酮、TEMED、甘氨酸等試劑均為成都市科龍化工試劑廠出品。

1.1.3 主要儀器

酶標儀(美國寶特Bio-Tek)，TGL-16M高速臺式冷凍離心機(長沙湘儀離心機儀器有限公司)，ACCULAB型精密電子天平(精度0.0001 g)，超低溫保存箱(青島海爾特種電器有限公司)，梅特勒—托利多實驗室pH計(FE20)，MP2002型電子天平(上海舜宇恒平科學儀器有限公司)，XK-96A快速混勻器(江蘇新康醫療器械有限公司)，電泳儀(美國Bio-Rad公司)，凝膠成像系統(GelDocEZ,美國Bio-Rad公司)，SCIENTZ-IID型超聲破碎儀(寧波新芝生物科技股份有限公司)，冷凍真空干燥機。

1.2 實驗方法

1.2.1 蛋白質標準曲線的制作

用PBS將2 mg·mL-1標準牛血清蛋白母液配制成0、25、50、125、250、500 μg·mL-1系列標準工作溶液。將25 μL標準蛋白質工作溶液和200 μL BCA工作液，充分混勻，37 ℃水浴30 min，取出后快速冷卻至室溫，在波長為562 nm處用酶標儀測定標準溶液的吸光度值，并與對應的濃度進行線性回歸，回歸方程為：y=0.001x+0.089(y—吸光度，x—蛋白質濃度μg·mL-1)，R2=0.997>0.995， 測定濃度范圍0～0.5 mg·mL-1，得標準蛋白質工作曲線。

1.2.2 煙葉中蛋白質含量的檢測分析[12-13]

準確稱取0.5 g粉末煙葉樣品于玻璃勻漿器中，用適量PBS后研磨。將勻漿液于4 ℃條件下，以4 000 r·min-1離心5 min。將上清液用中速濾紙過濾，離心分離得到的殘渣采用上述方法研磨、離心、過濾，重復上述操作2次。收集總過濾液用PBS定容至250 mL，得到樣品液。

取所得樣品液2 mL于10 mL離心管，加入3倍體積的PBS，混勻，標為1號待測液；另取上述所得的煙葉樣品液2 mL于10 mL離心管，加3倍體積的15%TCA，混勻，于37 ℃水浴中孵育10 min，在20～25 ℃條件下以10 000 r·min-1，離心10 min，取上清液標為2號待測液。用BCA法在酶標儀上測定1號和2號待測液的吸光值，將差值代入標準蛋白質的回歸曲線方程計算煙葉樣品蛋白質的含量。

1.2.3 苯酚法提取煙葉總蛋白[14-15]

利用苯酚法提取煙葉中蛋白質，稱取K326煙葉樣品2.5 g，加入適量預冷的提取緩沖液(蔗糖150 g，SDS 7.5 g，用Tris-HCl(pH 8.8)定容至500 mL，用時加4%β-巰基乙醇)，在勻漿器中充分研磨后于渦旋振蕩器上渦旋10 min充分混勻，冰浴超聲波破碎細胞5 min，重復以上操作4次。加1.5～2.0倍體積的飽和Tris酚后，再次重復2次上述操作。靜置分層，11 000 r·min-1，4 ℃離心25 min，另取10 mL的離心管備用，取上層酚相1.5 mL于離心管中，加5倍體積預冷的0.1 mol·L-1甲醇-醋酸銨(0.1 mol甲醇-醋酸銨，3.854 g醋酸銨，用甲醇定容至500 mL，含0.07%β-巰基乙醇)，混勻，-20 ℃下放置過夜。11 000 r·min-1，4 ℃，離心30 min，去上層清液，用預冷的含0.07% β-巰基乙醇的甲醇溶液洗滌沉淀。并用預冷的含0.07%β-巰基乙醇的丙酮溶液洗滌至上清液無色，-20 ℃下低溫真空干燥，制成蛋白質樣品干粉。在-80 ℃冰箱中保存待用。

1.2.4 SDS-PAGE電泳

煙葉蛋白樣品干粉與蛋白裂解液(硫脲2 mol·L-1，尿素42%，CHAPS 4%，二硫蘇糖醇65 mmol·L-1)1 mg∶30 μL的比例溶解，制成待分離樣。配置15%分離膠，5%濃縮膠，厚度為1 mm的凝膠進行電泳。將Marker與待分離樣品蛋白用2×蛋白染液按照1∶1的比例混勻，沸水浴中沸騰5 min，取出后10 000 r·min-1離心2～5 min，上樣。起始電壓80 V，當Marker到達分離膠后調至120 V，待最快的條帶移到凝膠底板3/4時完成電泳。用考馬斯亮藍快速染色(R250)方法進行凝膠染色，脫色過夜，再用BIO-RAD掃描儀進行掃描[16]。

1.2.5 煙葉中蛋白動態變化規律分析

利用Image Lab軟件對SDS-PAGE凝膠電泳圖數據進行處理，條帶編號數代表不同分子量的蛋白質，根據已知分子量大小的Marker條帶，便可知樣品條帶相對于Marker的分子量大小，體積指的是該條帶的蛋白質體積，而條帶百分比是指每一個條帶所占的整個的泳道所有條帶的體積的百分占比，根據其大小可以知道對應的蛋白質的含量，分析不同煙葉樣品中蛋白質分子量大小分布及不同分子量蛋白質含量的比例，由此明確不同部位或烘烤時間煙葉蛋白質的變化情況。

2 結果與分析

2.1 煙葉蛋白含量的變化規律

通過分析K322和紅花大金元煙葉不同烘烤時間段蛋白質含量的變化可知，鮮煙葉的蛋白質含量最高，成熟鮮煙葉的蛋白質含量通常在20%左右，隨著烘烤時間的增加，蛋白質會在烘烤過程中先快速降解再緩慢降解最后趨于平穩。由圖1可以分析得出，烘烤時間每增加10 h，蛋白質的含量大約減少2.5%。直至烘烤到140 h的時候，煙葉的蛋白質含量降到最低點，大概為6%，與最先沒有烘烤的煙葉的蛋白質的含量相比，大約降低至其1/3的量，結果如圖1。

2.2 上中下部葉片蛋白質分布規律

鮮煙不同部位葉片的蛋白質電泳結果如圖2，并用Image Lab軟件對電泳圖進行分析得到表1、表2和圖3。由圖2和表2可知，下部葉片有14條蛋白，分子量分布在11.8～89.4 ku，其中分子量為13.9、26.0、11.8、56.4 ku的蛋白含量較高。中部葉片有14條蛋白，分子量分布在12.0～90.5 ku，其中分子量為14.4、26.0、12.0、55.0 ku的蛋白含量較高。上部葉片約含有11條蛋白，分子量分布在11.9～72.0 ku，其中分子量為14.2、52.2、26.0、18.4 ku的蛋白含量較高。

圖1 煙葉不同烘烤時間段的蛋白質含量變化趨勢Fig.1 The protein content change trend of tobacco leaves at different flue-curing time

1，下部葉片；2，Marker；3，中部葉片；4，上部葉片1， Lower leaves; 2， Marker；3， Middle leaves；4， Upper leaves圖2 K326不同部位煙葉的蛋白質電泳圖Fig.2 The protein electropherogram of different K326 part leaves

表1標準蛋白泳道定量分析

Table1Quantitative analysis of standard protein lanes

條帶編號Number分子量Molecularweight相對前沿Relativefrontier體積Volume/Int條帶百分比Percentageoftheband泳道百分比Percentageoflane117000443523231213000168976504939500115602411411047200218525613513055500320584815014564300410332075737340051912321391348260062048401491449170081672561221181011010468723433

圖3 Marker對應泳道剖面圖Fig.3 The corresponding lane profile of marker

表2K326上、中、下部煙葉蛋白質泳道定量對比分析

Table2The quantitative comparative analysis of protein electropherogram lane from K326 upper， middle and lower tobacco leaves

泳道Lane下部葉Lowerleaves分子量Molecularweight/ku條帶百分含量Percentageoftheband/%中部葉Middleleaves分子量Molecularweight/ku條帶百分含量Percentageoftheband/%上部葉Upperleaves分子量Molecularweight/ku條帶百分含量Percentageoftheband/%18941590505——273830720157201935649655011552215944301942428413175382023821437702633088330733086872601392601542609882457924578245469210302131221605101951719612——11182031860718478121634316934——131393231443461424561411811512010611951

由表2可知，大分子蛋白(>40 ku)在上、中、下部葉片的含量分別為19.5%、16.3%、16%。中分子蛋白(20～40 ku)在上、中、下部葉片的含量分別為21.9%、33.1%、33.8%。小分子蛋白(<20 ku)在上、中、下部葉片含量分別為58.5%、50.5%、50.1%。煙葉中小分子量蛋白的含量最高，中分子蛋白含量較高，大分子蛋白含量最低。

2.3 不同烘烤時間煙葉蛋白質的分布規律

不同烘烤時間煙葉蛋白電泳如圖4，殺青煙葉有13條蛋白，分子量分布在13.4～74.6 ku，其中分子量為13.40、26.53、49.95 ku的蛋白含量較高；烘烤3 h煙葉有15條蛋白，分子量分布在12.06～70.72 ku，其中分子量為14.15、26.53、33.15、53.26 ku的蛋白含量較高；烘烤68 h煙葉有15條蛋白，分子量分布在13.21～64.65 ku，其中分子量為13.21、29.21、32.16、49.95 ku的蛋白含量較高。

由表3和圖5可看出，煙葉蛋白在不同烘烤時間段的變化情況，煙葉隨著烘烤時間的增加，易被分解的大分子量的蛋白質在不斷的進行降解，烘烤68 h煙葉樣品中蛋白最大分子量為64.65 ku，比殺青樣品中蛋白最大分子量小了近10 ku。蛋白質的種類增加，大分子量的蛋白質分解為多種中、小分子量的蛋白質。殺青樣品的大、中、小分子蛋白含量為20.4%、29.93%、49.67%；烘烤3 h煙葉樣品的大、中、小分子蛋白含量為15.66%、65.39%、18.95%；烘烤68 h煙葉樣品的大、中、小分子蛋白含量為28.12%、42.95%、28.93%。

1，Marker；2，烘烤3 h；3，殺青葉片；4，烘烤68 h1， Marker；2， 3 h flue-curing；3， Fixing；4， 68 h flue-curing圖4 不同烘烤時間K326中部煙葉蛋白質電泳圖Fig.4 The protein electropherogram of K326 middle leaves at different flue-curing times

表3不同烘烤時間K326中部煙葉的蛋白質泳道分析

Table3Analysis of protein lane of K326 middle leaves at different flue-curing time

條帶編號Number殺青0hFixing分子量Molecularweight/ku條帶百分含量Percentageoftheband/%烘烤3h3hflue?curing分子量Molecularweight/ku條帶百分含量Percentageoftheband/%烘烤68h68hflue?curing分子量Molecularweight/ku條帶百分含量Percentageoftheband/%1746203970721996465442265231055326122949952218349951641496813840591524430025536021028349276053523320331512143216102563183402304290229211104729216182653189225637098265314352454594235147892050217224309021870421018531182021819203517811176208618271401942460121516411177503817313321313404352163911115510331414151602148803015120600313212038

圖5 不同烘烤時間煙葉蛋白動態變化Fig.5 Dynamic changes in leaf protein at different flue-curing times

3 討論

本研究發現，隨著煙葉烘烤過程的進行，煙葉蛋白是一個不斷降解的過程，蛋白含量逐漸降低。在不同的烘烤時間段，煙葉內的蛋白質降解的速度也不相同，K326煙葉在烘烤0～50 h蛋白質的降解速度非常快，煙葉蛋白質的含量從19%降至9%；烘烤時間從80 h到最后的140 h后，煙葉蛋白質含量的變化已經趨于平緩，即在6%左右進行變化，這與李常軍等[17]的研究結果相似。

將分子量大于40 ku的蛋白歸類于大分子蛋白，分子量在20～40 ku的蛋白歸類于中分子蛋白，分子量小于20 ku的蛋白歸類于小分子蛋白。鮮煙上部葉片中大、小分子量蛋白含量比中、下部葉片多，鮮煙下部葉片中分子量蛋白含量較高，可能因為上部葉片受到的光照更充分，新陳代謝更強，且中分子蛋白分解比大分子蛋白快，造成了上部葉片的大、小分子量蛋白較多，中分子量蛋白明顯偏少的現象。鮮煙中、下部葉片的蛋白質數量、種類、不同分子量大小蛋白的含量比例都較為相似，而上部葉片與中、下部葉片存在著明顯的差異[18-20]。

不同烘烤時間段煙葉中蛋白的降解規律不同。殺青樣中分子量小于20 ku的小分子量蛋白含量占總蛋白條帶的49.67%，但是在后續烘烤過程中小分子量卻大幅度減少，這是由于鮮煙葉所積累的小分子蛋白在烘烤前期就快速分解為氨基酸，而小分子蛋白的分解和大分子蛋白的快速降解導致了烘烤3 h的樣品中中分子量蛋白含量比例大幅增加。

烘烤68 h的煙葉樣品中還是存在著較多的分子量在40 ku以上的蛋白質，推測這些大分子量的蛋白質應該是不易分解的膜蛋白或者結構蛋白等，相比烘烤3 h的煙葉樣品，68 h樣品的中分子量蛋白明顯減少，而小分子量蛋白有所增加，這是在烘烤過程中中分子量蛋白持續降解為小分子量蛋白，但不是很明顯，可能蛋白分解成了氨基酸參與煙葉內的美拉德反應，積累香氣物質[21-23]。

本文從煙葉不同部位及不同烘烤時間段對煙葉中蛋白的分布特點進行了分析，由于煙葉的烘烤是一個復雜的蛋白質的降解代謝過程，并且不同部位煙葉蛋白的分布規律還與光照、土壤氮源與自身合成有機物的傳遞、葉片新陳代謝機制等因素有著密不可分的關系，但是可以確定的是，上、中、下部葉片的蛋白存在著明顯差異，煙葉烘烤過程不同的烘烤階段中不同類別的蛋白降解規律也不是一樣的，現行的統一烘烤方式并不適合全部的葉片，若采用相對應各部位的烘烤工藝進行烘烤，將能進一步提升烘烤品質，提高煙葉價值。由于煙草生長過程中蛋白質的積累與后期烘烤中蛋白質分解是一個復雜的動態變化過程[24-26]，受多種因素的影響，因此如何充分調控不同部位葉片中蛋白質的有效代謝轉化，從而提升煙葉質量，有待進一步研究。

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Dynamicvariationrulesofproteindegradationinflue-curedtobaccos

WANG Wanneng1， XIANG Gangliao1， ZHAI Yuchen1， MA Kuoyan2， DAI Ya2， TAN Lanlan3

(1.CollegeofPharmacyandBiotechnology，ChongqingUniversityofTechnology，Chongqing400054，China; 2.ChongqingChinaTobaccoIndustryCo.，Ltd.，Chongqing400060，China; 3.SichuanChinaTobaccoIndustryCo.，Ltd.，Chengdu610000，China)

To analyze and clarify the regularity of protein change in different flue-curing and different flue-curing time of tobacco leaves， and to provide theoretical basis for improving tobacco leaf quality， the dynamic changes and distribution characteristics of tobacco leaves were analyzed by SDS-PAGE and other experimental techniques. The degradation rate of tobacco protein was different at different flue-curing time， and the content of tobacco protein was decreased from 19% to 9% at 0-50 h after flue-curing， and it tended to be gentle in the later flue-curing phase. The molecular weight distribution of leaf protein was between 11.8 and 90.5 ku， and there were significant differences in the content of tobacco protein in the upper， middle and lower leaves. The content of large and small molecular weight protein in the upper leaves was higher than that in the middle and lower leaves， and the content of middle molecular weight in the lower leaves was higher than the others. The degradation rule of different types of protein in different flue-curing stages of tobacco leaf were different.

tobacco; protein; SDS-PAGE; degradation

浙江農業學報ActaAgriculturaeZhejiangensis， 2017，29(12): 2120-2127

http://www.zjnyxb.cn

王萬能，項鋼燎，翟羽晨，等. 烤煙煙葉烘烤中蛋白質的降解動態變化規律研究[J].浙江農業學報，2017，29(12)： 2120-2127.

10.3969/j.issn.1004-1524.2017.12.22

2017-06-06

重慶中煙工業有限責任公司科技項目(2014Q116)

王萬能(1971—)，男，四川開江人，博士，教授，主要從事生物代謝工程方面的研究。E-mail: wannengw@cqut.edu.cn

S572

A

1004-1524(2017)12-2120-08

(責任編輯張 韻)