黃連對羥苯基丙酮酸雙加氧酶的原核表達和酶學性質

梁玉玲，佐藤文彥

(1.河北大學 生命科學學院，河北 保定 071002；2.河北省生物工程技術研究中心，河北 保定 071002； 3. 京都大學 大學院，日本 京都 606-8502)

黃連對羥苯基丙酮酸雙加氧酶的原核表達和酶學性質

梁玉玲1，2，佐藤文彥3

(1.河北大學 生命科學學院，河北 保定 071002；2.河北省生物工程技術研究中心，河北 保定 071002； 3. 京都大學 大學院，日本 京都 606-8502)

為了研究黃連對羥苯基丙酮酸雙加氧酶(CjHPPD)的功能和性質，在E.coli中異源表達其編碼cDNA得到了重組的CjHPPD． 經HPLC和LC-MS檢測確定重組CjHPPD具有催化對羥苯基丙酮酸形成尿黑酸的酶活性．酶學特性分析表明，CjHPPD催化尿黑酸形成的最適pH值為6.5，產物尿黑酸的積累至少在反應開始10 min內隨時間呈線形增長，最適反應溫度為30 ℃．以ρ-HPP為底物進行底物親和性分析表明，CjHPPD符合Michaelis-Menten動力學曲線，Km值為43.2 μmol/L．結果表明，CjHPPD的Km值明顯高于其他已報道的植物HPPD的Km值，高Km使得CjHPPD具有較強除草劑抗性．

黃連；對羥苯基丙酮酸雙加氧酶；原核表達；酶學性質；Km值

對羥苯基丙酮酸雙加氧酶(ρ-hydroxyphenylpyruvate dioxygenase，HPPD；EC.1.13.11.27)是生物體中酪氨酸分解代謝的重要酶[1]．催化對羥苯基丙酮酸(ρ-hydrotyphenylpyruvate，HPP)與O2形成尿黑酸(homogentisate)，包括了氧化脫羧、羥基化和分子內重排等反應過程[2-3]．HPPD廣泛存在于除少數革蘭氏陰性細菌之外的幾乎所有需氧生物中[4]，是一種含非血紅素Fe2+、依靠α-酮酸的雙加氧酶，鐵原子以非血紅素Fe2+作為酶的活性輔助因子參與了該復雜的反應過程．在植物和光合細菌中，尿黑酸還參與質體醌和生育酚生物合成途徑．HPPD是質體中這兩類重要異戊二烯醌類物質生物合成的關鍵酶，HPPD酶活性喪失或者受到抑制時，對植物細胞的直接影響是抑制質體醌和生育酚的合成，間接影響是抑制類胡蘿卜素的合成．后者引起類胡蘿卜素生物合成途徑的中間產物八氫蕃紅素的積累和質體的光氧化發生[5]，導致植物生長緩慢、葉片白化、枯死,直至整株植物死亡．HPPD成為新型除草劑靶標酶和生育酚代謝途徑工程的重要酶類．

盡管HPPD在植物體中具有重要的作用，到目前為止，只從少數幾種植物中克隆了HPPD的編碼基因或cDNA，包括紫蘇(Coleusblumei)、大麥(Hordeumvulgare)、胡蘿卜(Daucuscarota)、擬南芥(Arabidopsisthaliana)、玉米(Zeamays)、丹參(Salviamiltiorrhiza)毛狀根、水麻(Amaranthustuberculatus)等[6-11]．在植物組織中HPPD酶活性是低水平的，直接從植物體中分離HPPD酶蛋白困難較大．Garcia等[12]利用Southern雜交技術檢測擬南芥基因組中HPPD的拷貝數時發現，編碼HPPD的基因在整個基因組中只存在1個拷貝．在大麥中也只是檢測到HPPD的1個拷貝[6]．HPPD為新型除草劑靶標酶，目前發現玉米和水麻對HPPD抑制劑型除草劑表現出抗性，但是其抗性產生原因是植物對抑制劑的代謝，而不是其HPPD對抑制劑具有抗性[9,11]．前期研究發現黃連(Coptisjaponica)培養細胞對HPPD抑制型除草劑DTP(destosyl pyrazolate)具有抗性并克隆了HPPD cDNA[13]，本文通過在E.coli中異源表達具有活性的重組蛋白，研究其酶學特性，對進一步研究其抗性產生機理具有重要意義．

1 材料與方法

1.1 材料

攜帶有黃連hppd開放閱讀框架(ORF)的克隆載體pGEM-T easy/Cjhppd由本實驗室保存;原核表達載體pET-21 d購自Novagen公司;大腸桿菌表達菌株BL21(DE3) 購自Promerga公司．

1.2 方法

1.2.1 Cjhppd原核表達載體構建

用PCR方法從pGEM-T easy/Cjhppd擴增Cjhppd片段．上游引物 Fw：5′-TACTAACCATGGTTCCCAGCACAGCCTCCA-3′，該引物引入1個包含翻譯起始密碼子ATG的限制性酶NcoI酶切位點(劃線部分)；下游引物 Rv：5′-TATGAATTCTCAAATGCAACTATGCAGCAACA-3′與cDNA的3'-末端序列互補，在終止密碼子TGA后面加上1個EcoRI 限制性酶切位點(劃線部分)．PCR反應條件為：預變性 94 ℃ 2 min；30個循環反應，包括94 ℃變性15 s，56 ℃退火30 s，68 ℃延伸2 min；最后68 ℃延伸5 min．PCR產物回收純化后，用限制性內切酶NcoI/EcoRI消化，與經同樣限制酶消化的表達載體pET-21 d連接得到pET-21 d/Cjhppd．轉化大腸桿菌DH5α菌株，涂布LB+100 μg/mL Amp平板，37 ℃過夜培養．經菌落PCR和限制性酶切鑒定的陽性質粒pET-21 d/Cjhppd，以pET載體特異性引物T7 promoter primer 和T7 terminator primer對重組質粒的插入DNA片段進行雙向測序確保PCR擴增中沒有引入錯誤堿基后，再將重組質粒轉入大腸桿菌表達菌株BL21(DE3)感受態細胞，氨芐青霉素篩選陽性菌落，經菌落PCR和限制性酶切提取質粒鑒定陽性轉化子．

1.2.2 Cjhppd在大腸桿菌中的異源表達與重組蛋白提取

挑取重組菌株單菌落，接種于5 mL LB+100 μg/mL Amp液體培養基中(50 mL三角瓶中)，37 ℃，150 r/min過夜預培養，取1 mL預培養菌液接種于100 mL LB+100 μg/mL Amp液體培養基中(500 mL三角瓶中)振蕩培養，當OD600達到0.6 時加入IPTG至終濃度為1 mmol/L，30 ℃繼續培養8 h誘導重組蛋白表達后，8 000 r/min 4 ℃離心5 min收集菌體．用蛋白質提取緩沖液(50 mmol/L Tris-HCl pH 7.5，10%(體積分數)甘油，10 mmol/L巰基乙醇)重懸菌體，超聲波破碎菌體，離心收集蛋白質粗提液，按照GE Healthcare PD-10 column操作手冊脫鹽處理后得到重組CjHPPD酶液，每管200 μL分裝，-80 ℃保存，同時以空載體轉化菌pET-21d(BL21(DE3))做同樣處理作為對照．

1.2.3 重組蛋白CjHPPD的酶活性測定

1.2.3.1 酶促反應體系和對照反應體系 標準酶促反應體系為100 μL反應體系中含100 mmol/L磷酸鉀緩沖溶液(pH 6.5)，50 mmol/L抗壞血酸，10 μL(37.18 μg脫鹽蛋白)酶液，200 μmol/L對羥苯基丙酮酸(pH 7.7，購自Aldrich公司)．反應以加入底物ρ-HPP開始，反應體系在30 ℃保溫5 min．反應體系中加入終質量濃度為20 g/L的TCA停止反應，渦旋混勻后-80 ℃保存．測定反應產物時取出凍存樣品冰浴融化后，14 000 r/min 4 ℃ 離心5 min沉淀反應液中的蛋白質成分(按照實驗具體情況，此離心步驟也可在停止反應后立即完成)，收集上清液用于HPLC和LC-MS測定反應產物尿黑酸．酶學特性分析時對酶促反應時間、溫度、pH值、底物濃度等作相應調整．米氏常數Km值計算利用Kaleida Graph(Synergy Software，Reading，PA)軟件．

在確定酶催化活性實驗中除標準反應體系外，還設立了對照反應體系，分別為： 標準反應體系中不加入反應底物對羥苯基丙酮酸； 標準反應體系中不加入酶溶液；標準反應體系中加入經100 ℃加熱處理10 min的變性酶液取代酶溶液．

1.2.3.2 HPLC 測定酶促反應產物 通過測定酶促反應體系中產物尿黑酸的形成及產量來確定酶的活性．HPLC檢測使用Shimadzu LC-10A型高效液相色譜儀，Shimadzu SPD-10A紫外檢測器，Shimadzu C-R7A色譜處理機，C18反向柱(Inertsil ODS-3 (4.6 mm×250 mm; GL Sciences Inc．)；流動相為10 mmol/L乙酸∶甲醇=85∶15(體積比)，現用現配，超聲波處理10 min去除氣泡后使用；流速0．8 mL/min；柱溫40 ℃；樣品注入量50 μL；檢測波長280 nm，尿黑酸標準品(購自Sigma公司)作為對照．

1.2.3.3 LC-MS 檢測酶促反應產物 采用液相色譜-質譜聯用儀(LC-MS-2010A; Shimadzu，Kyoto，Japan)鑒定反應產物尿黑酸．LC-MS 條件：流動相為 20 mmol/L 醋酸銨(Ammonium acetate) pH 5.5，選擇SIM模式(掃描模式為負離子模式)，流速為0.5 mL/min，柱溫40 ℃，檢測280 nm UV吸收，尿黑酸標準品作為對照．

1.2.4 重組蛋白質CjHPPD酶學性質分析

1.2.4.1 酶促反應時間 先在小離心管中分別加入上述反應體系的緩沖液、抗壞血酸和底物，30 ℃恒溫水浴預保溫3 min，再加入酶溶液，開始計時．反應時間分別為0、1、2、3、4、5、10、20 min，加入TCA終止反應，HPLC法測定酶活性．

1.2.4.2 酶促反應最適溫度 采用標準反應體系，反應溫度分別設定為10、15、20、25、30、37、40、45、50 ℃，反應時間為5 min，加入TCA終止反應，HPLC法測定酶活性．

1.2.4.3 酶促反應最適pH值 使用不同的緩沖液調節反應體系的pH值，醋酸-醋酸鉀緩沖液(KA Buffer，pH值分別為 4.5、5.0、5.5)；磷酸鉀緩沖液(KP Buffer，pH值分別為 5.5、6.0、7.0、7.5、8.0)；Tris-HCl緩沖液(Tris-HCl Buffer，pH值分別為 7.5、8.0、8.5、9.0)．反應條件為30 ℃，5 min．加入TCA終止反應，HPLC法測定酶活性．

1.2.4.4Km值測定 100 μL標準酶促反應體系中改變底物的濃度，使底物終濃度分別達到2 、10、20、50、100 μmol/L，加入酶溶液開始反應．反應條件為30 ℃，5 min．加入TCA終止反應，HPLC法測定酶活性．實驗數據利用Kaleida Graph(synergy software，reading，PA)軟件計算米氏常數Km值．

1.2.5 其他方法

采用質量濃度100 g/L 的聚丙烯酰胺 SDS-PAGE分離重組蛋白，考馬斯亮藍(R250)染色，以確定重組酶蛋白分子質量．采用Bradford方法測定蛋白質濃度[14]，以牛血清白蛋白(BSA)為標準品．

2 結果

2.1 Cjhppd基因原核表達載體的構建

以克隆載體pGEM-T easy/Cjhppd為模板，在DNA聚合酶KOD Plus DNA polymease 催化下進行PCR擴增，產物經瓊脂糖凝膠電泳檢測，得1.3 kb特異DNA片段，與預期片段大小一致(圖1)，膠回收特異產物后，用NcoⅠ/EcoRⅠ雙酶切．同時雙酶切載體pET-21d，凝膠電泳檢測回收的酶切插入片段和載體(圖2)．用DNA Ligation Kit進行連接反應，連接產物轉化E.Coli感受態細胞DH5α，涂布LB+100 μg/mL Amp平板，37 ℃過夜培養．

1.1 kb plus DNA 標記；2-4.ORF PCR產物.圖1 瓊脂糖凝膠電泳分析PCR擴增產物Cjhppd ORF DNA片段Fig.1 Analysis of PCR product Cjhppd ORF by electrophroesis through agarose gel

1.1 kb Plus DNA 標記；2.pET-21d 的 NcoⅠ+Eco RⅠ雙酶切；3,4．ORF DNA 的 NcoⅠ+Eco RⅠ雙酶切. 圖2 瓊脂糖凝膠電泳檢測載體和目的片段酶切產物Fig.2 Analysis of degisted pET-21d and inster byelectrophroesis through agarose gel

2.2 原核表達載體的鑒定及轉化表達菌株

挑取生長的菌落進行菌落PCR，使用目的片段的正向引物Fw作為上游引物，載體的T7 terminator primer作為下游引物，擴增插入片段，以檢測插入片段的長度和插入片段的連接方向，篩選出了1個插入片段長度和方向都正確的陽性克隆(圖3)．提取重組菌質粒DNA，分別用NcoⅠ和EcoRⅠ單酶切得到了線形DNA；用NcoⅠ/EcoRⅠ雙酶切質粒DNA得到了預期長度的酶切片段(圖4)．說明Cjhppd的 ORF成功地構建到了表達載體pET-21d中，使Cjhppd處于T7轉錄元件的控制之下．

用鑒定好的重組質粒DNA 轉化BL21(DE3)感受態細胞,挑取生長的單菌落，培養后提取重組質粒DNA，對質粒DNA 進行NcoⅠ/EcoRⅠ限制性酶雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳鑒定酶切片段，得到了預期長度1.3 kb的片段．對重組質粒DNA進行雙向測序，測序引物為位于載體多克隆位點上下游的T7 promoterprimer 和T7 terminator primer，測序結果表明，插入片段核苷酸序列與CjhppdORF核苷酸序列完全相同．至此，將Cjhppd的開放閱讀框克隆到了大腸桿菌表達載體pET-21d中，并且轉化到大腸桿菌表達菌株BL21(DE3)中，獲得了Cjhppd的重組菌．

1.1 kb plus DNA 標記；2.陽性對照；3-8.菌落PCR.圖3 瓊脂糖凝膠電泳檢測重組質粒菌落PCR產物 Fig.3 Analysis of colony PCR product by electrophroesis through agarose gel

1.質粒 DNA；2.λDNA/Hin d Ⅲ marker；3.Nco Ⅰ+Eco RⅠ雙酶切.圖4 HPPD-pET-21d 質粒DNA限制性酶切產物瓊脂糖凝膠電泳Fig.4 Analysis the products of restriction enzyme digested HPPD-pET-21d plasmid DNA by electrophroesis through agarose gel

2.3 Cjhppd 基因在大腸桿菌中的表達

挑取含有重組質粒pET-21d/Cjhppd的重組大腸桿菌菌株BL21(DE3)單菌落，用終濃度為1 mmol/L的IPTG誘導重組蛋白表達．30 ℃、誘導時間為8 h時獲得了目的蛋白的高表達，其表達蛋白質的分子質量與CjHPPD蛋白質的推測分子質量47.3 ku基本吻合，而在轉入空載體對照中沒有此蛋白質條帶，圖5為SDS-PAGE電泳圖譜．

2.4 重組CjHPPD的酶活性測定

HPPD作為酪氨酸分解代謝中的重要酶類以及植物質體醌和生育酚合成途徑的關鍵酶，催化對羥苯基丙酮酸(HPP)合成尿黑酸(HMG)的反應．提取重組CjHPPD制備酶液加入標準反應體系進行酶促反應，反應產物作HPLC分析．結果顯示，標準酶促反應體系反應產物的HPLC檢測圖譜含有與產物尿黑酸標準品保留時間相同的色譜峰(圖6a，b)，即檢測到了產物尿黑酸的形成．而在空載體對照菌蛋白提取液的反應體系中沒有尿黑酸產物形成，只檢測到了底物對羥苯基丙酮酸的色譜峰(圖6c)．同時在其他幾種對照體系中也沒有檢測出尿黑酸(圖略)．

1.蛋白質分子質量標記；2.空載體對照 (pET-21 d)； 3.pET-21d/CjHPPD.箭頭所指為預期的重組蛋白.圖5 Coptis japonica HPPD 在E．coli中表達的SDS-PAGE圖譜Fig.5 SDS-PAGE analysis of overproduction of CjHPPD in recombinant E.coli

a．反應產物標準品尿黑酸(HMG)，標準品濃度100 μmol/L，樣品用量為25 μL；b．CjHPPD酶促反應體系，10 μL酶液 (37.18 μg脫鹽蛋白)；c．空載體對照菌反應體系.HMG為反應產物尿黑酸；HPP為酶作用底物對羥苯基丙酮酸.圖6 CjHPPD酶促反應體系反應產物的HPLC圖譜Fig.6 HPLC chromatogram of CjHPPD reaction production

2.5 LC-MS鑒定反應產物

為了進一步確定產物是尿黑酸，對酶促反應產物又進行了LC-MS檢測，檢測圖譜如圖7．實驗結果說明，表達的CjHPPD重組酶蛋白能夠催化由對羥苯基丙酮酸形成尿黑酸的生化反應，是有活性的酶蛋白．

2.6 重組CjHPPD的酶學性質分析

2.6.1 產物標準品HMG的HPLC標準曲線測定

精確配制產物標準品尿黑酸溶液，濃度分別為25、50 、75 、100 、200 μmol/L，混勻后加入TCA，渦旋，14 000 r/min離心5 min，使其與酶促反應產物的處理方式一致．分別取上清液在相同色譜條件下進樣50 μL，以HPLC峰面積為縱坐標、標準品濃度為橫坐標用Microsoft Excel 2003做出曲線如圖8，色譜產物吸收峰面積與標準品濃度之間呈現出正線性關系，所以，酶促反應產物的色譜吸收峰面積可以表示出酶促反應產物的生成量，即酶的活性．

HPP為底物對羥苯基丙酮酸；HMG為反應產物尿黑酸.圖7 CjHPPD酶促反應體系反應產物的LC-MS分析圖譜Fig.7 LC-MS analysis of CjHPPD reaction product HMG

圖8 反應產物尿黑酸HPLC標準曲線Fig.8 HPLC standard curve of reactionproduct homogentisate

2.6.2 酶促反應的時間曲線

選擇標準酶促反應體系，反應溫度37 ℃，以加入底物開始反應，反應時間分別為0、5、10、15、20、30、60、120 min，加入TCA停止反應后，離心取上清液，HPLC檢測不同反應時間內的產物形成量，圖9a顯示，CjHPPD 催化對羥苯基丙酮酸轉化成產物尿黑酸的生成量至少在10 min以內與反應時間呈線性關系，即隨著時間的延長產物的積累成正比增加，但是當反應時間超過10 min以后反應產物的積累有所下降．所以選擇反應時間5 min作為酶學性質分析時的反應時間．

2.6.3 CjHPPD的最適作用溫度

選擇標準酶促反應體系，先在選定溫度下預熱3 min，加入酶液開始反應，保溫5 min，加入TCA終止反應，渦旋混勻后離心，取上清液用于HPLC測定反應產物．所用反應溫度為10、25、30、37、40、45、50 ℃．圖9b顯示CjHPPD催化反應的最適溫度為30 ℃，當高于或低于這一溫度時，在相同的反應體系中產物的生成量都會降低，即酶的活性降低．

2.6.4 CjHPPD 的最適pH值

選擇標準反應體系，改變pH值緩沖液的使用，使反應體系處于不同的pH值．使用醋酸鉀緩沖液(KA buffer)：pH值分別調整為 4.5、5.5、6.0；磷酸鉀緩沖液(KP buffer)：pH值分別調整為5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0．反應條件為30 ℃，5 min．反應產物經HPLC測定．圖9c顯示在底物HPP濃度為200 μmol/L，酶量為10 μL(37.2 μg蛋白質)，反應溫度為30 ℃條件下，CjHPPD催化對羥苯基丙酮酸轉變為尿黑酸的最適pH值為6.5．

a.酶促反應的時間曲線;b.溫度對酶促反應的影響;c.pH值對酶活性的影響;d.底物HPP濃度對酶活性的影響.圖9 CjHPPD酶學特性分析Fig.9 Analysis of characteristics of CjHPPD

圖10 CjHPPD 催化底物HPP 形成HMG反應的Km值計算Fig.10 Caculation of Km of CjHPPD for substrate HPP formation to HMG

2.6.5 底物濃度對CjHPPD活性的影響——Km值計算

為了研究CjHPPD與底物HPP的親和性，在不同濃度的底物條件下進行酶促反應并測定酶的活性．底物濃度分別為2、10、20、50、100、200 μmol/L，酶的用量為10 μL (37.2 μg蛋白質)，反應溫度設為30 ℃，pH值為6.5，反應時間為5 min．以加入底物開始反應，加入TCA終止反應，反應產物經HPLC測定．以100 μmol/L尿黑酸標準品進樣量50 μL的吸收峰面積換算出生成產物的物質的量(nmol)，以其代表酶的活力，制作出曲線如圖9d．以每mg酶蛋白每min催化酶促產應產生HMG的物質的量(nmol)作為酶促反應速度(nmol/min/mg)，將實驗數據利用Kaleida Graph(synergy software，reading，PA) 軟件處理并計算米氏常數Km值(圖10)，數據符合Michaelis-Menten酶促動力學公式，結果顯示當底物濃度低于20 μmol/L時，酶促反應速度隨著底物濃度的增長呈直線增長；在底物濃度大于20 μmol/L低于100 μmol/L時，酶促反應速度隨底物濃度的增加而增加，但是增加速度減慢；當底物濃度達到100 μmol/L時，酶促反應速度達到最大值，再增加底物濃度酶促反應速度不再增加．vmax為11.13 nmol/min/mg，CjHPPD的酶促動力學常數Km值為43.2 μmol/L．

3 討論

對羥苯基丙酮酸雙加氧酶(ρ-hydroxyphenylpyruvate dioxygenase，HPPD；EC.1.13.11.27)是生物體中芳香族氨基酸(苯丙氨酸、酪氨酸)分解代謝過程中的重要酶類．在植物體和光合細菌中，對羥苯基丙酮酸雙加氧酶除了參與酪氨酸等的分解代謝，它還是質體醌和生育酚生物合成的關鍵酶．HPPD成為新型除草劑靶標酶和生育酚代謝途徑工程的重要酶類．隨著HPPD抑制型除草劑的使用，研究者們利用轉基因技術培育轉基因植物以擴大該類除草劑的除草譜和用于敏感作物[15-16]．Garcia等[17]1997年從胡蘿卜培養細胞中分離出了胡蘿卜HPPD的cDNA，這是第1次從植物中分離克隆HPPD的cDNA．胡蘿卜培養細胞的天然HPPD和重組的胡蘿卜HPPD均受到其抑制劑的強烈抑制作用，即天然HPPD和重組HPPD均對除草劑高度敏感．已經研究的動物、植物和細菌等的HPPD均被其抑制劑強烈地抑制[18]．

本研究從對HPPD抑制劑具有抗性的黃連培養細胞中獲得的黃連HPPDcDNA進行原核表達得到重組CjHPPD，以對羥苯基丙酮酸(ρ-HPP)為底物進行體外酶促反應，經HPLC檢測酶促反應的產物為尿黑酸(HMG)，產物經LC-MS檢測確定．結果表明重組蛋白具有HPPD酶活性．

酶學特性分析實驗結果表明，CjHPPD催化反應的最適溫度為30 ℃，最適pH值為6.5；在最適條件下，底物ρ-HPP濃度對酶活性的影響符合米氏公式，Km值為43.2 μmol/L．關于植物HPPD的酶學特性前人有一些研究報道，例如玉米HPPD最適溫度為30 ℃，最適pH值為7.3，Km值為5 μmol/L[19]；胡蘿卜重組HPPD在反應溫度30 ℃，pH值6.0的反應條件下，Km值為(7．5 ± 2.5)μmol/L[18]；Garcia等[12]在研究擬南芥重組HPPD酶學特性時發現，其最適pH值為一個較寬的范圍(6.5～7.5)，Km值為5～8 μmol/L；稗草barnyardgrass (Fchinochloacrus-galli) HPPD的Km值為4.3 μmol/L[20]．與其他植物HPPD相比較，CjHPPD的Km值明顯高于其他植物種類，但是低于經過定點突變修飾的細菌HPPD G336W(Km值138 μmol/L)[3]．CjHPPD對于底物ρ-HPP的高Km值表明CjHPPD催化大量的底物HPP以增加質體醌代謝流量，從而提高了黃連培養細胞對其競爭性抑制劑DTP的抗性．然而在研究中發現，CjHPPD的氨基酸序列同源性與其他植物HPPD表現出較高的同源性，尤其是與鐵結合相關氨基酸殘基等活性位點的氨基酸序列相似性很高，CjHPPD的高Km值的分子機理需要進一步的研究．HPPD抑制劑型除草劑作為HPPD的競爭性抑制劑影響敏感植物的生長，同時由于HPPD是質體醌和生育酚生物合成途徑的限制因子[21]，筆者發現的對除草劑具有抗性的CjHPPD為植物生育酚生物合成代謝途徑工程以及抗除草劑基因工程提供了一個很好的途徑．

致謝：感謝日本京都大學大學院生命科學研究科Minami Hiromichi博士對本文LC-MS檢測的幫助；感謝國家留學基金委的資助.

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Prokaryoticexpressionandcharacterizationofρ-hydroxyphenylpyruvatedioxygenasefromculturedCoptisjaponicacells

LIANGYuling1，2，SATOFumihiko3

(1.College of Life Sciences，Hebei University，Baoding 071002，China； 2.Biological Engineering Technology Research Center in Hebei Province,Baoding 071002,China; 3.Graduate School of Biostudies，Kyoto University，Kyoto 606-8502，Japan)

To characterize theρ-hydroxyphenylpyruvate dioxygenase from culturedCoptisjaponicacells (CjHPPD)，recombinant protein was produced inE．coli． When the enzyme activity of recombinant CjHPPD was measured in vitro，the formation of homogentisate was determined by HPLC and confirmed by LC-MS analysis． Enzyme assays indicated that the optimum pH for the reaction of HPP transfer to homogentiaste was approximately 6.5． A time course study showed that the accumulation of homogentisate was linear with time for at least 10 min in the presence of 10 μL(37.18 μg) of desalted enzyme and 200 μmol/L hydroxyphenlpyruvate． The optimum temperature was 30 ℃． Characterization of the substrate affinity of recombinant CjHPPD using HPP as the substrate indicated that CjHPPD also followed Michaelis-Menten-type kinetics andKmwas estimated to be 43.2 μmol/L． TheKmof CjHPPD was much higher than the reported values for the HPPD enzyme from other plants． Since HPPD inhibitors are known to compete for the substrate for binding，the higherKmvalue of HPP might affect herbicide tolerance．

Coptisjaponica;ρ-hydroxyphenylpyruvate dioxygenase; prokaryotic expression; characterization;Kmvalue

10.3969/j.issn.1000-1565.2017.06.008

2017-05-26

河北省自然科學基金資助項目(C2013201126)

梁玉玲(1965—),女，河北定州人，河北大學教授，主要從事植物分子生物學與基因工程研究.

E-mail: yuling_liang@163.com

Q786

A

1000-1565(2017)06-0605-09

趙藏賞)