異功散對小鼠慢性病貧血的治療作用

鄭 秦, 姜一陵, 季玉婷, 夏樂敏, 張愛萍, 石 嶺, 戴程怡, 薛 城, 鄒純樸, 羅梅宏

(1. 上海市寶山區中西醫結合醫院暨上海中醫藥大學附屬曙光醫院寶山分院血液科, 上海 201999;2. 上海中醫藥大學基礎醫學院內經教研室, 上海 201203)

·論 著·

異功散對小鼠慢性病貧血的治療作用

鄭 秦1, 姜一陵1, 季玉婷1, 夏樂敏1, 張愛萍1, 石 嶺1, 戴程怡1, 薛 城1, 鄒純樸2, 羅梅宏1

(1. 上海市寶山區中西醫結合醫院暨上海中醫藥大學附屬曙光醫院寶山分院血液科, 上海 201999;2. 上海中醫藥大學基礎醫學院內經教研室, 上海 201203)

目的觀察異功散(YGS)對慢性病貧血(ACD)小鼠的治療作用。方法取8周齡雄性C57BL/6小鼠，腹腔注射脂多糖(0.5 mg/mL), 第6 d腹腔注射酵母糖A(32 mg/mL)，第11 d模型小鼠隨機分為模型組、中藥干預組，另設空白對照組。當日起給予藥物干預，中藥干預組灌胃YGS水煎液，劑量為每日15.413 g/kg生藥; 空白對照組、模型組灌胃0.2 mL超純水。采集外周血、肝、脾組織, 采用自動細胞計數儀檢測小鼠血常規; 比色法檢測血清鐵(SI)、未飽和鐵結合力(UIBC);ELISA法檢測鐵蛋白(SF); 普魯士藍染色觀察肝、脾組織鐵，采用Image-Pro Plus 6.0軟件分析普魯士藍鐵離子陽性面積百分比，RT-PCR檢測小鼠肝臟鐵調素基因(HAMP) mRNA的表達。結果與模型組比，連續給藥1周和2周后中藥干預組小鼠血紅蛋白(HB)、紅細胞計數(RBC)、紅細胞比容(HCT)均有顯著提高(P＜0.01或P＜0.05)，紅細胞壓積(MCV)無明顯改善(P＞0.05), 血清SI和UIBC也明顯上升(P＜0.01或P＜0.05), 血清SF及肝、脾組織鐵含量顯著降低(P＜0.01或P＜0.05),肝臟HAMP mRNA顯著下降(P＜0.01或P＜0.05)。結論YGS可以改善ACD小鼠貧血，調節其鐵代謝的紊亂，這一作用可能與其對鐵調素的下調有關。

慢性病貧血(ACD); 異功散(YGS); 治療; 鐵調素

慢性病貧血(ACD)即炎性貧血，是指急性或慢性炎癥相關的疾病引起的貧血，這些疾病包括感染性疾病(細菌、真菌、病毒)，非感染性疾病(自身免疫性疾病、腫瘤、慢性腎病、心衰、肥胖等)，甚至老化(前炎癥過程)[1]。目前ACD已成為住院病人最常見的貧血類型，其發病率僅次于缺鐵性貧血[2]。ACD是鐵代謝相關疾病，其主要病理特點之一是，鐵過多貯存于單核巨噬系統，不能循環再利用，導致可利用的鐵減少，紅細胞生成不足而出現貧血。結合中醫理論有關“脾主運化”及“脾為氣血生化之源”等理論，我們認為作為精微物質的鐵，要通過“脾主運化”才得以正常輸布、利用，“脾主運化”參與機體的整個鐵代謝過程。因此，應用“運脾法”可實現鐵在體內的重新分布，即促進單核巨噬系統內的鐵釋放入血，以滿足造血所需，從而改善貧血[3]。異功散(YGS)是“運脾法”代表方劑，其中的陳皮意在行氣化滯，醒脾助運的作用，使該方劑具有補而不滯、補中有行的優點，臨床用于ACD治療，可起到促進鐵循環再利用的作用，因此較之單純的健脾補腎生血收效更佳。為探討YGS調節ACD鐵代謝的作用機制，我們觀察了YGS對ACD模型小鼠的血液學、鐵代謝的影響及其與鐵調素(Hepcidin)的關系。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF級8周齡雄性C57BL/6小鼠(20 g左右)，購自上海斯萊克實驗動物有限公司[SCXK(滬)2012-0002]，飼養于屏障設施的IVC飼養籠中(IVC-Ⅱ型，蘇州市馮氏實驗動物設備有限公司)。

1.2 試劑和儀器

脂多糖(LPS)(美國Sigma公司, 批號: L2755)、酵母糖A(美國Sigma公司，批號: Z4250)、血清鐵檢測試劑盒(美國Pointe Scientific公司，批號:MI48188)、小鼠鐵蛋白ELISA試劑盒(美國ICL Lab公司, 批號E-90F)、普魯士藍(PB)染液(武漢賽維爾生物科技有限公司, 批號: G1029)、BAY 120型全自動細胞計數儀(德國西門子公司)、Nano Drop 200型微量紫外分光光度計(美國Thermo公司)、ECLIPSE Ci型生物正置顯微鏡(日本Nikoni公司)、EMuleC7超薄切片機(美國Thermo公司)、CFX96 RT-PCR 儀器(美國Bio-Rad公司)。

1.3 藥物

YGS 組方: 生曬參(去蘆)40 g, 產地: 吉林，上海雷允上中藥飲片廠, 批號: 1607229; 炒白術40 g,產地: 浙江, 上海雷允上中藥飲片廠, 批號: 1606097;白茯苓(去皮)40 g，產地: 安徽，上海雷允上中藥飲片廠，批號: 1606096; 蜜炙甘草40 g，產地: 新疆，上海雷允上中藥飲片廠，批號: 1603118; 陳皮40 g, 產地: 浙江，上海雷允上中藥飲片廠，批號: 1607129，用 8 倍水加減煎煮2 次，每次 1 h，合并濾液, 調整 pH 值至中性, 180 ℃蒸餾濃縮定容至 100 mL, 60 ℃真空加壓干燥，粉碎成100目粉，由上海中醫藥大學藥學院制備，常溫干燥保存。

1.4 方法

1.4.1 造模 按照文獻方法復制模型[4]， 小鼠經適應性飼養3 d后，先按0.1 mL/10g體質量的劑量，給小鼠腹腔注射LPS溶液(0.5 mg/mL)后6 d，再按0.25 mL/10g，腹腔注射酵母糖A溶液(32 mg/mL)后5 d，造模成功，成功率約80%。

1.4.2 分組及干預方法按隨機數字表法將48只C57 BL/6小鼠隨機分為3組, 分為空白對照組、模型組、中藥干預組, 每組各16只, 每組于連續給藥1周及2周后，分別處死8只。YGS按臨床常用量由人參(去蘆)15 g、白術 15 g、茯苓(去皮)15 g、炙甘草 15 g、陳皮15 g 組成。給藥劑量參照《藥理實驗方法學》[5]中人和小鼠間按體表面積折算的等效劑量比值估算為15.413 g生藥/kg/d，中藥配置終濃度為1.5413 g/mL的水溶液, 按0.01 mL/g給中藥干預組灌胃?？瞻讓φ战M、模型組每只灌胃0.2 mL超純水，采集外周血、肝、脾組織標本。

1.4.3 觀察指標及方法

1.4.3.1 血液學指標 經眼眶后靜脈叢采集約400 μL全血, 置于EDTA抗凝微量采血管內, 送至上海市食品藥品檢測所藥理毒理實驗室，使用動物專用自動細胞計數儀檢測血紅蛋白(Hb)等部分血液學指標。

1.4.3.2 血液生化指標的檢測 經眼眶后靜脈叢采集全血約200 μL于微量血清分離管內, 3 000 r/min,25 min，4℃分離血清，約40 μL。按依照試劑說明書，比色法檢測血清鐵(SI)、未飽和鐵結合力(UIBC)、ELISA法檢測鐵蛋白(SF)。

1.4.3.3 肝、脾組織PB染色 肝、脾組織樣本固定在質量分數4%多聚甲醛，石蠟包埋, 然后切片,4 mm×11 mm×1 mm, PB染色, 顯微境觀察并采集圖像。Image-Pro Plus 6.0軟件分析PB鐵離子陽性面積百分比(含鐵血紅素)方法: 每組內每張切片在200倍視野下進行拍照。拍照時盡量讓組織充滿整個視野, 保證每張照片的背景光一致。應用Image-Pro Plus 6.0軟件對每張照片進行分析得出每張照片藍色鐵離子占整個組織面積的比率即PB陽性面積百分比。

1.4.3.4 熒光實時定量PCR檢測 首先, 使用RNAiso Plus 試劑盒(D9108A, 日本TaKaRa公司)，按說明書提取肝組織RNA; 然后使用PrimeScript試劑盒(日本TaKaRa公司)，按說明書在RT-PCR儀器反轉錄RNA; 進而使用SYBR Premix Ex試劑盒(DRR420A,美國Bio-Rad公司)，按說明書在RT-PCR儀器檢測β-actin, 鐵調素基因(HAMP) mRNA表達, β-actin作為內參。

β-actin引物序列

上游: 5'-AGCTGAGAGGAAATCGTGCG-3';

下游: 5'-GTGCCACCAGACAGCACTGTG-3';

HAMP mRNA引物序列

上游: 5'-AGCACCACCTATCTCCATCAAC-3';

下游: 5'-TGTCTCTCTTCCTTCTCTTCTGC-3'

1.5 統計學方法

數據采用SPSS 22.0分析軟件進行統計分析。計量資料數據以x-± s表示。經方差齊性檢驗, 方差齊的數據, 多組間比較采用單因素方差分析, 兩兩比較采用LSD 檢驗, P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 異功散可以改善ACD小鼠貧血

如表1, 與空白對照組比，模型組小鼠血紅蛋白(HB)、紅細胞計數(RBC)、紅細胞比容(HCT)、紅細胞壓積(MCV)水平均顯著下降(P＜0.01); 與模型組比, 連續給藥1周及2周后，中藥干預組小鼠HB、RBC、HCT含量均顯著提高(P＜0.01或P＜0.05)，MCV無明顯改變(P＞0.05)。

2.2 異功散可調節ACD小鼠鐵代謝

2.2.1 異功散可提高ACD小鼠外周血可利用鐵水平與空白對照組相比, 模型組SI、UIBC明顯下降(P＜0.01或P＜0.05), SF明顯升高(P＜0.01或P＜0.05);與模型組相比, 連續給藥1周及2周后，中藥干預組小鼠SI、UIBC的含量顯著提高(P＜0.01或P＜0.05),SF 明顯降低(P＜0.01或P＜0.05)(表2)。

表 1 各組小鼠部分血液學指標變化

表 2 各組小鼠外周血鐵代謝指標變化

2.2.2 異功散可以降低ACD小鼠脾組織鐵含量 與空白對照組比，模型組小鼠脾組織鐵含量均明顯升高(P＜0.05); 與模型組比，連續給藥1周及2周后，中藥干預組小鼠脾組織鐵含量均顯著下降(P＜0.01)(表 3、圖 1)。

表 3 各組小鼠脾鐵含量變化 %

2.2.3 異功散可降低ACD小鼠肝組織鐵含量 與空白對照組比，模型組小鼠肝組織鐵含量均明顯升高(P＜0.01或P＜0.05); 與模型組比, 連續給藥1周及2周后，中藥干預組肝組織鐵含量顯著下降(P＜0.01)(表 4, 圖 2)。

2.2.4 異功散可降低ACD小鼠肝HAMP mRNA表達 與空白對照組比，模型組小鼠肝組織HAMP mRNA的相對表達量均明顯升高(P＜0.01); 與模型組比, 連續給藥1周及2周后, 中藥干預組肝組織HAMP mRNA的相對表達量顯著下降(P＜0.01或P＜0.05)(表 5)。

3 討論

中醫沒有ACD的病名，通常將其與缺鐵性貧血一并歸屬于“萎黃”、“黃病”或“血虛證”等范疇。然而，與缺鐵性貧血不同，ACD所表現的低鐵血癥不是由于鐵的供應不足，而是由于鐵的吸收、利用等應答過程失調，導致供應的鐵不能被吸收入血、貯存的鐵不能動員入血進行再利用即鐵穩態失衡。這一病理特點提示，ACD不是單純的健脾補腎所能湊效的疾病。據此, 課題組提出[3]“受氣取汁, 變化而赤”是脾正常調節鐵代謝的過程，ACD 的病理環節是“中焦受氣取汁”的過程受損; 脾有運化“水濕精微”的功能, 鐵是體內的精微物質之一，鐵代謝紊亂反映的是脾運失常，臨床應以“運脾”法恢復其功能。YGS是由四君子湯加味而成，方中“參、術、苓、草, 甘溫益胃, 有健運之功, 具沖和之德”(《名醫方論》)，加陳皮意在行氣化滯，醒脾助運，有補而不滯、補中有行的優點，為運脾立法之良方。鐵作為精微物質，需依賴“脾運”之功在機體內正常運轉分布，發揮其功能。異功散之“補中有行”的特點使得該方能參與鐵的整個代謝過程，尤其是鐵的動員、循環和再利用。

圖 1 各組小鼠脾組織鐵(PB×400)

圖 2 各組小鼠肝組織鐵(PB×400)

表 4 各組小鼠肝組織鐵含量變化 %

表 5 各組小鼠肝組織HAMP mRNA的相對表達量

目前認為，鐵調素是機體調節鐵代謝的核心蛋白, 在ACD 發病機制中起著至關重要的作用[6,7]。鐵調素是在肝臟中由HAMP 基因編碼的小分子肝肽,是維持機體鐵穩態的關鍵。其主要在炎癥、缺氧、鐵過載等情況下抑制小腸對鐵的吸收, 促進巨噬細胞對鐵的攝入, 從而調節鐵的吸收和循環[8-11]。前期我們觀察了YGS對炎癥介導的小鼠體內鐵代謝紊亂的作用。進一步研究發現[12,13]，YGS對正常小鼠鐵代謝并沒有影響，但能通過降低炎癥介導的小鼠血清IL-6的升高，抑制肝臟鐵調素表達，改善血清低鐵狀態，糾正肝組織鐵貯存過多。由此我們推測異功散可通過抑制鐵調素的過表達來調節炎癥介導的鐵代謝紊亂。那么異功散是否可以通過抑制鐵調素的過表達來調節ACD鐵代謝紊亂從而糾正貧血呢？為回答這一問題，本研究選用了公認的ACD小鼠模型[4,14]觀察研究異功散對ACD小鼠模型的治療作用。

文獻[4]及我們的預實驗結果均表明，注射酵母糖A 5 d后小鼠HB、RBC、HCT、MCV開始明顯降低，SI減少，SF升高，表現出典型ACD的病理特征改變。因此，我們在造模第5日起給藥，連續給藥1周或2周，觀察中藥的作用。雖然MCV無明顯變化，但HB、RBC、HCT均明顯提高，說明異功散可以改善ACD小鼠貧血。

機體內16%的鐵以鐵蛋白及含鐵血黃素形式儲存于肝、脾及骨髓中[15]，ACD時鐵過多地蓄積于肝、脾等系統內，不能循環再利用，導致可利用的循環鐵減少，導致貧血。如果能將此部分鐵動員再利用，恢復鐵的正常分布，那么就有可能使ACD得到根本的治療。雖然目前骨髓鐵仍是評價機體儲存鐵的金標準，然而臨床上由于取材欠佳等原因，約有20%骨髓標本不能對機體存儲鐵做出正確的判定，因此臨床上常采用SF評估機體儲存鐵的情況[16]。已有研究表明[17]，骨髓鐵與SI、SF呈正相關; 與UIBC呈負相關。由此可見，SI、UIBC、SF可以很好地評價機體鐵代謝的情況。本文研究表明，ACD小鼠肝臟HAMP mRNA表達升高, 血清中SI、UIBC下降, SF升高, 肝脾組織鐵增高，給予異功散干預后，小鼠肝臟HAMP mRNA表達相對下降，血清SI、UIBC顯著增加，SF及肝脾組織鐵明顯減少。由此推測，異功散可以通過降低鐵調素的表達，從而動員肝、脾組織內的儲鐵向外周血轉移，提升循環中可利用的鐵水平,以供造血所需，增加紅細胞生成，改善貧血。

本實驗結果已初步證明，異功散通過降低鐵調素的過表達從而調節鐵代謝的紊亂，改善貧血，為開展進一步的研究，闡明諸如藥效關系、藥效成分及作用機理等科學問題，賦予該方應用于臨床的更多科學依據，具有實際的臨床意義。另外, 本研究中, 無論是連續給藥1周還是2周, 異功散均可以調節ACD小鼠鐵代謝，改善貧血，兩者并沒有明顯的差異，可能異功散的效價的提高并不在于時間的延長，而在于藥物濃度的改變。因此，后續的工作，我們將改變給藥濃度，進一步探尋異功散治療ACD最佳濃度及相關的作用機制。

[1] Poggiali E, Migone De Amicis M, Motta I, et al. Anemia of chronic disease: a unique defect of iron recycling for many different chronic diseases [J]. Eur J Intern Med, 2014, 25(1):12-17.

[2] Fraenkel PG. Understanding anemia of chronic disease[J].Hematology Am Soc Hematol Educ Program, 2015, 2015: 14-18.

[3] 羅梅宏. 從脾主運化和運脾生血理論探討慢性病貧血的中醫病機和治療[J]. 中醫雜志, 2013, 54(18):1556-1557.

[4] Lasocki S, Millot S, Andrieu V, et al. Phlebotomies or erythropoietin injections allow mobilization of iron stores in a mouse model mimicking intensive care anemia[J]. Crit Care Med, 2008, 36(8):2388-2394.

[5] 徐叔云. 藥理實驗方法學[M]. 北京: 人民衛生出版社,2002:20.

[6] Theurl I, Aigner E, Theurl M, et al. Regulation of iron homeostasis in anemia of chronic disease and iron deficiency anemia: diagnostic and therapeutic implications[J]. Blood,2009, 113(21):5277-5286.

[7] Sun CC, Vaja V, Babitt JL, et al. Targeting the hepcidinferroportin axis to develop new treatment strategies for anemia of chronic disease and anemia of inflammation[J]. Am J Hematol, 2012, 87(4):392-400.

[8] Rochette L, Gudjoncik A, Guenancia C, et al. The ironregulatory hormone hepcidin: a possible therapeutic target?[J]. Pharmacol Ther, 2015, 146:35-52.

[9] Singh B, Arora S, Agrawal P, et al. Hepcidin: a novel peptide hormone regulating iron metabolism[J]. Clin Chim Acta, 2011,412(11-12):823-830.

[10] Ward DM, Kaplan J. Ferroportin-mediated iron transport:expression and regulation[J]. Biochim Biophys Acta, 2012,1823(9):1426-1433.

[11] Silva B, Faustino P. An overview of molecular basis of iron metabolism regulation and the associated pathologies[J].Biochim Biophys Acta, 2015, 1852(7):1347-1359.

[12] 鄭秦, 管宇, 王志成, 等. 異功散對脂多糖介導的小鼠鐵代謝紊亂的影響[J]. 中醫雜志, 2015, 56(20):1767-1770.

[13] Zheng Q, Guan Y, Xia L, et al. Effect of Yi Gong San decoction on iron homeostasis in a mouse model of acute inflammation[J]. Evid Based Complement Alternat Med, 2016, 2016:2696480.

[14] Rivera S, Ganz T. Animal models of anemia of inflammation[J]. Semin Hematol, 2009, 46(4):351-357.

[15] 郁敏燕, 朱俐. 低氧與鐵代謝相關蛋白[J]. 中國生物化學與分子生物學報, 2012(10):897-905.

[16] 彭碧, 曾白華, 陳小紅. 鐵代謝相關血清學指標在貧血診斷中的應用價值[J]. 國際檢驗醫學雜志, 2014(5):552-554,556.

[17] 魏小平, 馬澤榮, 鄭貴星, 等. 骨髓鐵與常用血清鐵指標的相關性研究[J]. 國際檢驗醫學雜志, 2011(14):1546-1547,1549.

Therapeutic Effects of Yi Gong San Decoction on Anemia of Chronic Disease in Mouse

ZHENG Qin1, JIANG Yi-ling1, JI Yuting1, XIA Le-ming1, ZHANG Ai-ping1,SHI Ling1, DAI Cheng-yi1, XUE Cheng1, ZOU Chun-pu2, LUO Mei-hong1

(1. Department of Hematology, Shanghai Baoshan Hospital of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine (Baoshan Branch of Shuguang Hospital Affiliated to Shanghai University of Traditional Chinese Medicine), Shanghai 201900, China; 2. Neijing Department, School of Basic Medical Science, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, Shanghai 201203, China)

ObjectiveTo observe the therapeutic effects of Yi Gong San decoction (YGS) on anemia of chronic disease (ACD) in mouse.MethodsTotally 48 male 8-week-old male C57 BL/6 mice were randomly divided into blank control group, model group, intervention group. Each group was sacrificed 8 mouse after the continuous administration of 1 week or 2 weeks. The model group and intervention group intraperitoneally injected with zymosan A after 6 days of intraperitoneally injected with LPS. After 5 days of zymosan A injection, YGS (15.413 g per day) was administered to mice intragastrically in intervention group for successive 1 or 2 weeks while 0.2 mL of ultra-pure water was administered to mice intragastrically in blank control group and the model group. The mouse blood routine was measured by automatic cell counting. Colorimetric method was used to detect serum iron (SI) and unsaturated iron binding (UIBC). ELISA was used to detect ferritin (SF). The ratio of iron in liver and spleen were analyzed by software using Prussian blue staining. The positive area of Prussian blue iron was analyzed by Image-Pro Plus 6.0 software. The expression of hepcidin antimicrobial peptide (HAMP) mRNA in mouse liver was detected by RT-PCR.ResultsIn the 1 or 2 weeks, the content of hemoglobin (HB),erythrocyte count (RBC), hematocrit (HCT) in mice was significantly increased (vs model group, P＜0.01 or P＜0.05); Hematocrit (MCV) was not changed (P＞0.05). The SI and UIBC was increased (VS model group, P＜0.01 or P＜0.05); the SF and the ratio of iron in liver and spleen reduced significantly(VS model group, P＜0.01or P＜0.05). Liver HAMP mRNA was significantly decreased (P＜0.01 or P＜0.05).ConclusionYi Gong San decoction can improve the degree of anemia and adjust the iron metabolism disorder in mouse of anemia of chronic disease by decreasing HAMP mRNA relative expression.

Anemia of chronic disease (ACD); Yi Gong San decoction (YGS); Treatment; Hepcidin

Q95-33

A

1674-5817(2017)06-0421-07

10.3969/j.issn.1674-5817.2017.06.001

2017-08-10

國家自然科學基金青年項目(81102569), 國家自然基金面上項目(81774271), 上海衛生和計劃生育委員會科研項目(201440587), 上海市自然科學基金面上項目(16ZR1425400)

鄭 秦(1986-), 碩士研究生, 住院醫師, 主要研究方向: 中醫藥治療血液病的臨床與實驗研究。

E-mail: 670251899@qq.com

鄒純樸(1971-), 醫學博士, 副教授, 碩士研究生導師, 主要研究方向: 內經理論臨床應用。

E-mail: chunpuzou@shutcm.edu.cn

羅梅宏(1971-), 醫學博士, 主任醫師, 碩士研究生導師, 主要研究方向: 中醫藥治療血液病的臨床與實驗研究。E-mail:lmh021009@163.com