應用微衛星DNA標記對福建亞種獼猴遺傳多樣性的分析

周建華, 李志雄, 楊燕燕, 謝金東 , 俞春英, 王訓立

(1. 福建中醫藥大學實驗動物中心, 福州 350122;2. 福建省計劃生育科學技術研究所, 福州 350011)

應用微衛星DNA標記對福建亞種獼猴遺傳多樣性的分析

周建華1, 李志雄2, 楊燕燕1, 謝金東1, 俞春英1, 王訓立1

(1. 福建中醫藥大學實驗動物中心, 福州 350122;2. 福建省計劃生育科學技術研究所, 福州 350011)

目的研究福建亞種獼猴的遺傳多樣性水平，為獼猴遺傳質量監測方法提供基礎資料。方法采用20個微衛星DNA(SSR)標記技術，經基因組DNA提取、PCR擴增、非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳等，對28只福建亞種獼猴遺傳多樣性進行分析，用POPGENE 1.32等軟件統計分析。結果福建亞種獼猴20個微衛星位點共檢測到等位基因200個，觀察等位基因數(Na)為 10.0000±3.1119; 有效等位基因數(Ne)為6.8438±2.4905; 期望雜合度(He)為0.8509±0.0564; 觀察雜合度(Ho)為0.4607±0.1247; 香隆信息指數(I)為2.0166±0.3463; 多態信息含量(PIC)為0.8154±0.0665; 顯示檢測的20個微衛星DNA位點均存在高度的遺傳多態性，其中有17個位點偏離Hardy-Weinberg平衡(P＜0.01)。結論有效地分析了福建亞種獼猴群體的遺傳多態性，為今后建立福建亞種獼猴遺傳質量監測方法提供理論依據。

微衛星標記; 福建亞種獼猴; 遺傳多樣性

我國有6個獼猴亞種[1], 在形態、行為、生理生化和遺傳等生物學特性方面各亞種之間存在較大差異, 其中福建亞種(Macaca mulatta littoralis)尚未被規模化開發成實驗動物。利用獼猴種質資源, 有助于開發高標準的具有自主知識產權的非人靈長類實驗動物及重大疾病的研究模型，有利于豐富非人靈長類實驗動物資源利用的多樣性。所以，研究福建亞種獼猴的遺傳背景特性，為福建亞種獼猴遺傳監測方法提供基礎資料，對福建亞種獼猴實驗動物化進程, 具有重要意義。微衛星DNA(microsatellite DNA)，也稱為簡單序列重復(simple sequence repeat, SSR)、短串聯重復序列(short tandem repeat,STR)，由于在基因組內核心序列重復數目的不同，產生了DNA多態性。與其它分子標記相比，微衛星DNA標記具有數量多、分布廣、共顯性遺傳、多態性豐富、且選擇中性、重復性好、易檢測，可提供高分辨率的遺傳信息等特點，已廣泛應用于遺傳圖譜的構建，親緣關系、遺傳多樣性分析，品種及菌株鑒別等[2-5]，是一種理想的分子標記。本研究從福建亞種獼猴的原主產地——福建武夷山區野捕來的野生猴群中隨機抽取28只，應用20個微衛星DNA標記對該猴群進行遺傳多樣性檢測，以期獲得福建亞種獼猴群體的遺傳概貌信息，為建立福建亞種獼猴遺傳質量監測方法提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物和基因組DNA提取

野捕福建亞種獼猴28只，雌雄各半, 9～14歲,體質量 6～11 kg[特許獵捕證(閩): (獵)字 2008-1]，飼養于普通級動物實驗室[SCXK(閩)2010-0002]、[SYXK(閩)2010-0005]。自上肢靜脈空腹抽取全血2 mL，EDTA抗凝。采用Promega基因組DNA純化試劑盒提取DNA，操作步驟見說明書。

1.2 主要試劑和儀器

Wizard?Genomic DNA Purification Kit試劑盒(Promega公司，美國)、Gotaq?Green Master Mix試劑盒(Promega公司，美國)、pBR322 DNA/MspI標記物(TIANGEN公司，中國)。凝膠成像系統(BioRad公司，美國)，電泳儀、垂直電泳槽(北京六一儀器廠，中國)和ABI Veriti梯度PCR儀(ABI公司, 美國)。

1.3 引物設計及PCR擴增

自GenBank網站及相關文獻[6-11]查取50個具有多態性高的微衛星DNA標記，上海生工生物工程有限公司合成。

PCR 擴增: 反應體系 25 μL。反應程序為: 95 ℃預變性3 min; 94 ℃變性30 s, 40～61 ℃復性30 s,72 ℃延伸60 s，30個循環，72 ℃最終延伸7 min。擴增產物4 ℃保存。

1.4 電泳及結果記錄

50個微衛星DNA位點中有20個位點呈特異性擴增，且表現不同程度的多態性(每個微衛星位點都有5個以上等位基因)。20個微衛星標記在染色體上的分布等信息見表1。

20個位點擴增產物經質量分數2%瓊脂糖凝膠電泳測定是否在長度范圍之內；后經質量分數8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳、銀染和凝膠成像系統照相保存。

1.5 統計分析

電泳圖帶經BioRad凝膠成像系統分析, 以大小不同的擴增片段(核苷酸條帶分子量大小)為不同的等位基因從小到大的順序分別依次定名為A、B、C、D、E……(1、2、3、4、5……)等。用POPGENE version 1.32軟件計算出各基因位點的觀察等位基因數(observed number of alleles, Na)、有效等位基因數(effective number of alleles, Ne) 、等位基因頻率(gene frequency)、期望雜合度(He)、觀察雜合度(Ho)、香隆信息指數(Shannon’s information index, I)等指標, 并計算多態信息含量(polymorphism information content, PIC)。同時檢驗群體的Hardy-Weinberg 遺傳平衡狀態。

2 結果

2.1 PCR擴增結果檢測

采用質量分數8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳20個微衛星位點的PCR擴增產物, 本文以D21S1246位點的電泳圖譜為例說明(圖1)。

2.2 不同福建亞種獼猴個體間DNA多態性分布信息

對28只福建亞種獼猴的20個微衛星DNA位點的等位基因多態性分析，顯示其能反映出該猴群個體間的遺傳概貌情況(表2)。

2.3 福建亞種獼猴群體遺傳多樣性分析

根據各微衛星位點的基因型，利用POPGENE version 1.32軟件計算出各位點Na及其頻率、Ne、Ho、I等指標(表3、表4)。

20個微衛星位點共檢測到等位基因200個，Na在5～16個，平均為10個(10.0000±3.1119),其中，最多的位點是D7S503，有16個等位基因，最少的位點是D1S548，有5個等位基因。Ne在3.7333～11.6148個(6.8438±2.4905), 其中, D1S207位點最高, D1S548位點最低。He在0.7455～0.9305(0.8509±0.0564), 其中，D1S207位點最高，D1S548位點最低。Ho在0.3214～0.7500(0.4607±0.1247)，其中，D2S1333位點最高，D21S1246、D14S255、D18S537、D1S548位點較低。I在1.3998～2.5963(2.0166±0.3463)，其中，D7S503位點最高，D1S548位點最低。PIC在0.6862～0.9074(0.8154±0.0665)，其中，D1S207位點最高，D1S548位點最低。實驗顯示，20個微衛星位點均存在高度的遺傳多態性。經Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗顯示，2 0個微衛星位點中除D6S493、D5S820、D2S1333 位點外，其余17個位點均偏離Hardy-Weinberg平衡(P＜0.01)。

3 討論

通常用多個基因位點的遺傳多樣性參數平均值來描述群體的遺傳多樣性，本研究中各微衛星位點的Na為10個; Ne為6.8438個; He為0.8509; Ho為0.4607; I平均值為2.0166; PIC為0.8154(均大于0.5),各微衛星位點均屬于高度多態性位點，由此可見，本研究的猴群等位基因數多、多態信息含量高、雜合度大，說明該猴群基因型一致性不高，遺傳變異大，遺傳多樣性豐富。

表 1 20個微衛星DNA標記的相關信息Table 1 The information of 20 microsatellite DNA markers

本研究檢測的2 0個微衛星位點，除位點D6S493、D5S820、D2S1333外，有17個偏離Hardy-Weinberg平衡(P＜0.01)，說明檢驗的猴群存在雜合子缺失現象。17個微衛星位點處于Hardy-Weinberg不平衡狀態，其原因可能與野生獼猴的生活習性有關，野生猴群由猴王統治(時間長也會有更替), 其有優先交配權，其它雄猴交配機會偏少，且外來進群的獼猴極少，猴群長時間處于非隨機交配體制中，存在著一定程度的近交繁殖[12]。

圖 1 D21S1246位點PCR擴增產物的聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測結果Figure 1 The polyacrylamide gel electrophoresis image of PCR products at D21S1246 locus

本研究與徐玉蕊等[6]對安徽本省的野生獼猴福建亞種的遺傳多態性研究所篩選的14個多態性微衛星位點比較, 在全部的14個位點中，只有D5S820、D1S207、D18S537、D7S503、D6S311、D1S548、D3S1768、D6S2741等8個位點一樣顯現多態性，且只有D1S548等位基因數目相同(都是5個)，說明雖是同一亞種，不同產地、不同群體的遺傳多樣性也有較大差異; 二者更多的生物學特性差異有待進一步研究。

微衛星標記技術是實驗動物種質遺傳多樣性監測和譜系構建的重要手段，已在非人靈長類動物遺傳監測、親子鑒定等得到了有效應用[13-18]。本實驗應用20個微衛星引物，對28只野生福建亞種獼猴個體進行PCR擴增，結果呈現出明顯的DNA多態性，說明這20個微衛星標記具有一定的代表性，能反映出福建亞種獼猴個體間的遺傳概貌，可有效地作為福建亞種獼猴群體的遺傳質量監測和譜系構建的微衛星標記。

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表 4 福建亞種獼猴群體20個微衛星位點的遺傳多態性Table 4 The genetic diversity measured at 20 microsatellite loci of Macaca mulatta littoralis population

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Analysis on Genetic Diversity of Macaca mulatta littoralis by Using Microsatellite DNA Markers

ZHOU Jian-hua1, LI Zhi-xiong2, YANG Yan-yan1, XIE Jin-dong1, YU Chun-ying1, WANG Xun-li1
(1. Laboratory Animal Center, Fujian University of Traditional Chinese Medicine, Fuzhou 350122, China;2. Fujian Research Institute of Family Planning, Fuzhou 350011, China)

ObjectiveTo analyze the genetic diversity of Macaca mulatta littoralis and providing basic data for genetic quality monitoring methods of the population.MethodsTwenty-eight Macaca mulatta littoralis were genotyped by using 20 microsatellite DNA markers, DNA was extracted from blood and amplified by PCR, and PCR products were analyzed by non-modified polyacrylamide gel electrophoresis.Every microsatellite locus was calculated by software POPGENE 1.32 and Excel.ResultsAll 20 microsatellite loci were highly polymorphic, 200 alleles were found in the population.The number of alleles(Na), effective number of alleles (Ne), expected heterozygosity (He), observed heterozygosity (Ho),Shannon's information index (I) and polymorphism information content (PIC) were ranged from 5 to 16,3.7333 to 11.6148, 0.7455 to 0.9305, 0.3214 to 0.7500, 1.3998 to 2.5963, and 0.6862 to 0.9074, with an average of 10, 6.8438, 0.8509, 0.4607, 2.0166 and 0.8154, respectively. All of 17 loci showed significant deviations from Hardy-Weinberg equilibrium.Conclusions There are high genetic diversity in Macaca mulatta littoralis of this colony. The experiments can provide a theoretical foundation for establishing genetic quality monitoring method with specific microsatellite loci.

Microsatellite marker; Macaca mulatta littoralis; Genetic diversity

Q95-33

A

1674-5817(2017)06-0434-08

10.3969/j.issn.1674-5817.2017.06.003

2017-04-27

福建省實驗動物研究重點項目(2014Y0080)

周建華(1969-), 男, 碩士, 高級實驗師, 研究方向: 實驗動物學。E-mail: zjh001866@sina.com

王訓立(1964-), 男, 研究員,

E-mail: wxl@fjtcm.edu.cn