兔斯氏艾美耳球蟲熒光定量PCR檢測方法的建立

溫福利, 鄭和平, 黨 源, 薛來恩, 張詩蘭

(南京軍區福州總醫院比較醫學科, 福州 350025)

兔斯氏艾美耳球蟲熒光定量PCR檢測方法的建立

溫福利, 鄭和平, 黨 源, 薛來恩, 張詩蘭

(南京軍區福州總醫院比較醫學科, 福州 350025)

目的建立熒光定量PCR檢測兔斯氏艾美耳球蟲的方法。方法根據斯氏艾美耳球蟲(內轉錄間隔區1)ITS1序列區設計特異性引物，構建重組質粒，并作為標準品繪制標準曲線，對建立的熒光定量PCR檢測方法進行特異性、敏感性和重復性試驗。結果建立的熒光定量PCR能特異性地檢測兔斯氏艾美耳球蟲，且可檢測到含一個卵囊DNA的樣本。該方法的重復性較好，組內、組間重復試驗的變異系數均小于2%。結論建立了一種特異性好、敏感度高、可靠的檢測兔斯氏艾美耳球蟲熒光定量PCR方法。

兔斯氏艾美耳球蟲; 熒光定量PCR; 檢測

隨著醫學、生命科學等領域的快速發展，實驗兔在科研、教學中的應用越來越廣, 實驗兔的質量控制也愈受重視。兔球蟲病是危害較嚴重的一種寄生蟲病，致病蟲株的種類繁多，其中寄生于肝臟的斯氏艾美耳球蟲是致病性最高的種類之一[1,2]。

兔球蟲主要以飽和鹽水漂浮法或直接壓片法進行檢測, 但費時費力, 存在漏檢的可能。閆文朝等[3]根據斯氏艾美耳球蟲內轉錄間隔區1,2(ITS1/2)序列超變區設計種特異引物, 建立了靈敏、特異的PCR檢測方法。近年來, 實時熒光定量PCR技術因特異性好、可定量、高敏感性、重復性好、高通量等優點, 被廣泛的應用于藥物療效考核、基因表達分析、轉基因研究、病原體檢測等諸多領域的定量及定性檢測[4,5]。樊翀宇等[6]通過TaqMan探針法建立了E. Stiedai的熒光定量PCR檢測方法, 目前未見斯氏艾美耳球蟲SYBR Green實時熒光定量PCR檢測E.stiedai的報道。本研究利用實時熒光定量PCR技術建立一種科學、準確的斯氏艾美爾球蟲分子生物學檢測方法, 為兔球蟲病的防治提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 蟲種來源

斯氏艾美耳球蟲(E. stiedai)、大型艾美耳球蟲(E. magna)、腸艾美耳球蟲(E. intestinalis)、黃艾美耳球蟲(E. falvescens)4種兔艾美耳球蟲卵囊均由中國農業大學索勛課題組提供。

1.2 主要試劑、儀器

SanPrep柱式質粒DNA小量抽提試劑盒、DNA膠回收試劑盒、植物基因組DNA快速抽提試劑盒、一步法快速感受態細胞制備試劑盒均購于上海生工生物有限公司。pMD?18-T Vector、10×PCR Buffer、DNA Marker等均購于大連寶生物工程有限公司。SMA4000微量分光光度計購自美國Merinton公司; HC-2518R高速冷凍離心機購自安徽中科中佳儀器有限公司; PCR反應擴增儀購自美國BIO公司;DYY-6C型穩壓穩流電泳儀購自北京六一; FR980凝膠成像系統購自上海復日科技有限公司; StepOne型熒光定量PCR儀購自美國ABI公司。

1.3 引物設計和cDNA的提取

用軟件Primer Premier 5.0設計兔斯氏艾美爾球蟲的ITS1區的引物, 即: F(5’→3’): TGGCTTTCGCCAACCAACAT, R(5’→3’): CTGCCTGCGCCAGTAGTAAC，擴增片段261 bp，引物由上海生工生物有限公司合成。分別將106個卵囊和2 000個卵囊置于含磁珠的振蕩器震蕩20 min，然后按照植物基因組D N A快速抽提試劑盒說明書提取DNA，-20℃保存。

1.4 質粒標準品的制備

1.4.1 目的基因的擴增及回收 以提取的E. stiedai卵囊DNA為模板, 利用設計的引物擴增目的片段。PCR擴增反應體系為25 μL, 反應條件為: 95 ℃，預變性3 min; 94 ℃，變性30 s; 57 ℃，退火30 s；72℃，延伸30 s，共35個循環，72 ℃延伸5 min。反應結束后，取5 μL進行1.5%瓊脂糖凝膠電泳。

1.4.2 構建重組質粒 將凝膠回收的PCR產物與PMD-18T載體連接，并將其轉入感受態大腸埃希菌DH5α中，藍白斑篩選出疑似克隆的白色菌落。將疑似克隆的菌落進行大量培養后，使用SanPrep柱式質粒D NA小量抽提試劑盒提取重組質粒DNA，送上海生工生物公司進行測序，把序列比對正確的陽性重組質粒作為實時熒光定量PCR 反應用的標準品。

1.5 實時熒光定量PCR 反應及定量標準曲線建立

實時熒光定量PCR 反應以陽性重組質粒作為模板，上、下游引物(10 μmol/L)各 0.4 μL, SybrGreen qPCR Master Mix(2 ×)，模板DNA 1 μL，補加雙重蒸餾水至20 μL。實時熒光定量PCR反應條件是:95 ℃, 預變性3 min; 進行45個循環: 95 ℃，變性15 s, 57 ℃, 退火 20 s, 72 ℃, 延伸 30 s。微量分光光度計測定陽性重組質粒的濃度, 計算質粒濃度的拷貝數量為3.6×108拷貝/μL, 將重組質粒進行10 倍梯度稀釋，用于熒光定量PCR標準曲線的建立。

1.6 特異性、敏感性、重復性試驗

對1個、5個、10個、25個、50個E. stiedai，以及E. magna、E. intestinalis和 E. flsvescens的DNA 分別為模板單獨進行實時熒光定量PCR 反應，并用雙蒸水作為陰性對照，檢驗該方法的特異性和確定其最低檢測限。用不同梯度的稀釋液，檢測該方法的重復性，數據以x-±s表示。

2 000個E. stiedai卵囊的DNA提取液20 μL(原液)，按照下列方法進行稀釋: 1個卵囊=DNA原液(0.5 μL)+稀釋液(24.5 μL), 取混合液0.5 μL作DNA模板; 5個卵囊=DNA原液(0.5 μL)+稀釋液(4.5 μL),取混合液0.5 μL作DNA模板; 10個卵囊=DNA原液(0.5 μL)+ 稀釋液(2 μL), 取混合液0.5 μL作 DNA模板; 25個卵囊=DNA原液(0.5 μL)+稀釋液(0.5 μL), 取混合液0.5 μL作DNA模板; 50個卵囊=DNA原液(0.5 μL)+ 稀釋液(0 μL), 取混合液 0.5 μL 作DNA模板。

2 結果

2.1 E. stiedai ITS1區基因的PCR擴增

用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測E. stiedai ITS1基因的PCR擴增產物，擴增的片段在200～300 bp，與預期片段(261 bp)基本一致(圖1)。

圖 1 E. stiedai區基因的PCR擴增結果Figure 1 The amplification of the gene in ITS1 region of E. Stiedai

2.2 重組質粒的鑒定

經藍白斑篩選的陽性克隆，擴大培養的菌液，送上海生工有限公司進行測序，其測序的結果在NCBI中進行比對，所擴增的基因序列與GenBank上已經發表的匹配率99%(圖2)。

2.3 標準曲線的建立

圖 2 序列比對結果Figure 2 The result of sequence alignment

重組質粒的連接和轉化效率較高, 根據公式計算得, 重組質粒的拷貝數為3.6×108拷貝/μL, 將其進行10倍梯度的稀釋，取3.6×101拷貝/μL～3.6×108拷貝/μL八個梯度的質粒標準品為模板進行的實時熒光定量PCR檢測, 由圖3可以看出, 在指數增長期時, 曲線是平行的, 說明實時熒光定量PCR的擴增效率比較相近。由圖4可以看出, 八個梯度的質粒標準品有一個共同的特征峰，基本無其它雜峰, 說明方法可靠。以質粒標準品濃度的log值為橫坐標、擴增曲線的Ct值為縱坐標構建的標準曲線為Y=-5.043×log(x)+51.815, 擴增效率為57.88%,相關系數R2為0.999(圖5)，這表明本研究建立的實時熒光定量PCR方法具有良好的線性關系，可信度高。

2.4 特異性和敏感性試驗

對1個、5個、10個、15個、25個、50個E.stiedai卵囊的DNA及E. magna、E. Intestinalis、E. flsvescens的DNA進行實時熒光定量PCR。由擴增曲線可知，含有E. stiedai的DNA的樣品均可看到光滑的擴增曲線, 而E. magna，E. intestinalis，E. flsvescens的DNA樣品均沒有擴增曲線(圖6)。這表明該方法的特異性強。此外，由溶解曲線(圖7)也可以看到, 含有兔斯氏艾美爾球蟲卵囊DNA的樣品均有一個特征峰，而E. magna, E. intestinalis,E. flsvescens DNA樣品的熔解曲線基本是水平的，即無熔解曲線，再次證實該方法的特異性極強。

對1個、5個、10個、15個、25個、50個E. stiedai的DNA進行實時熒光定量PCR檢測，結果顯示，最低檢測量為1個E.stiedai卵囊的DNA，換算成拷貝數為42.65拷貝/μL(表1)，說明該方法的敏感性高。

圖 3 重組質粒實時熒光定量 PCR 的擴增曲線Figure 3 Dynamic curve of RT-PCR for recombinant plasmid

圖 4 重組質粒實時熒光定量PCR的熔解曲線Figure 4 Solubility curve of RT-PCR for recombinant plasmid

2.5 重復性實驗

原始的DNA按照10倍梯度稀釋, 進行組間和組內的重復試驗, 每個試驗重復3次(表2)。組內、組間重復試驗的變異系數, 分別是0.27%～1.73%、0.48%～1.95%，均小于2%，表明該方法的重復性良好。

3 討論

兔球蟲中，E. stiedai 是致病性最強的種類之一，成年兔感染時一般沒有明顯的臨床癥狀，而幼兔感染會出現輕微的厭食、腹瀉甚至黃疸、死亡等癥狀，主要表現為肝臟的濁腫、壞死[7]。Jing等[8]對Eimeria在中國家兔的感染狀況調查表明，總感染率為41.9%。宋鴻雁等[9]對江蘇省4個實驗兔供應基地球蟲感染情況進行了調查，結果顯示感染率為100%，共檢測出10種艾美爾球蟲。樵星芳等[10]對重慶市中藥研究院實驗兔場球蟲感染種類進行調查表明, E. Stiedai的感染率最高, 達23%。因此需要開發一種快速、有效、特異的方法對兔群進行跟蹤監測, 及時做出預防措施，減少損失。

圖 5 實時熒光定量PCR 的標準曲線Figure 5 Standard curve of RT-PCR

Fernandez等[11]通過序列特征擴增特定區域基因的標記技術, 利用多重PCR的方法鑒定7種艾美耳球蟲屬。Carvalho等[12]用20個卵囊成功鑒定了7種感染能力強的艾美爾球蟲即E.mitis、E. maxima、E. acervulina、E. tenella、E. necatrix、E. brunetti和E. praecox。You[13]采用多重PCR擴增ITS1區域的序列, 使用1～5 pg的DNA樣本, 即可檢測出E. tenella、E. acervulina、E. maxima和E. necatrix。Yan等[14]對6種兔艾美耳球蟲(E.stiedai、E. intestinalis、E. flavescens、E. media、E. magna和E. irresidua)的ITS1和ITS2進行擴增，通過多重PCR診斷方法成功鑒定三種高致病性兔艾美耳球蟲(E. stiedai、E. intestinalis和 E. Flavescens)。Hassan 等[15]采用ITS1-PCR擴增方法檢測兔艾美耳球蟲對兔的感染情況，結果顯示，在球蟲感染兔的第15日，不規則的黃白色病變結節呈現在肝臟上，能夠在腸道上皮組織的病理切片上檢查到E. stiedae裂殖體和配子體; 第21～24日, 可以看到明顯的肝腫大和肝腹水; 在兔感染球蟲的第12日，肝組織PCR擴增的結果首次呈陽性, 第18日糞便樣品的PCR檢測結果呈陽性, 而血液樣品PCR的結果仍呈陰性。由此說明，PCR作為常規的診斷技術可有效的檢測兔球蟲的波動，對于預防兔球蟲的感染有著重要的作用。

圖 6 不同個數E. stiedai卵囊和其他球蟲卵DNA RT-PCR的擴增曲線Figure 6 Dynamic curve of RT-PCR for different number of E. stiedai and other kinds of Coccidia eggs

圖 7 不同個數E. stiedai卵囊和其他球蟲卵DNA RT-PCR的熔解曲線Figure 7 Solubility curve of RT-PCR for different number of E. stiedai and other kinds of Coccidia eggs

表 1 特定個數E.stiedai卵囊DNA的熒光定量PCR檢測Table 1 The detection a certain number of E.stiedai DNA on RT-PCR

表 2 熒光定量PCR組內重復性試驗結果Table 2 The result of RT-PCR repetitive experiments in the group

普通PCR方法操作簡單、成本低，但是檢測技術比較耗時，產物需純化才能測序，假陽性率高[16]。實時PCR因其靈敏度高、特異性好等優點，在微生物的分子生物學、生物學等研究領域得到了越來越廣泛的應用, 如小麥鐮孢菌病害[17]、大豆孢囊線蟲[18]。合格標準品的制備在實時熒光定量PCR技術中對靶標基因的準確定量有著重要的作用。體外人工合成的單鏈DNA、質粒DNA、純化的dsDNA及體外轉錄的RNA等常被用于構建標準曲線的標準品[19,20]。其中重組質粒DNA和體外轉錄的RNA標準品是較為常見的標準品。因保存穩定、易于標準化, 重組質粒作為標準品的應用也較多[21,22]。因此本研究通過構建ITS1基因的重組質粒作為實時熒光定量PCR檢測方法標準曲線的標準品。實驗結果表明, 利用重組質粒的DNA作為標準品，建立的實時熒光定量PCR檢測E. stiedai的方法具有足夠的特異性和高敏感性, 可用于E. stiedai的定量檢測。

本研究根據E. stiedai ITS1區域的基因保守序列設計引物, 采用重組質粒標準品建立檢測E. stiedai的實時熒光定量PCR標準曲線，為檢測感染兔E. stiedai提供快速定量檢測的技術支持，也為E. stiedai的防治打下一定的技術基礎。本研究建立的實時熒光定量PCR方法對E. stiedai的檢測特異性強，靈敏度高，可檢出含一個卵囊的DNA樣本，適用于E. Stiedai感染初期的定量檢測，有利于實驗兔場及時做好E. Stiedai的預防措施，減少經濟損失。同時，也能為科研實驗提供質量合格的實驗兔，保證科研實驗數據的可靠性。

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Detection of Eimeria Stiedai by Real-Time PCR

WEN Fu-li, ZHENG He-ping, DANG Yuan, XUE Lai-en, ZHANG Shi-lan
(Department of Comparative Medicine, Fuzhou General Hospital of Nanjing Command, PLA, Fuzhou 350025, China)

ObjectiveTo develop the method for quantitatively detecting Eimeria stiedai (E. stiedai)by Real-Time PCR (RT-PCR).MethodsSpecific primers were designed and synthesized according to a part of the sequence of ITS1 region of E. stiedai. The recombinant plasmid was constructed to established the standard curve of RT-PCR. The specificity, sensitivity and reproducibility of the RT-PCR method were performed.ResultThe method was specific and sensitive for detection of E. stiedai. Meanwhile,the sensitivity of the present method could detect the DNA of one E. stiedai and the variation coefficients of intra-assay and inter-assay were less than 2.0% respectively.ConclusionThe established RT-PCR is a specific, sensitive and reliable method for the quantitative detection of E. stiedai.

E. stiedai; Real-Time PCR(RT-PCR); Detection

S858.28 Q95-33

A

1674-5817(2017)06-0448-07

10.3969/j.issn.1674-5817.2017.06.005

2017-10-26

福建省科技計劃引導性項目(2015Y0075)和南京軍區福州總醫院臨床應用研究專項(2015L01)

溫福利(1987-), 男, 技師, 主要從事實驗動物寄生蟲學研究, E-mail: wen_fuli@163.com

鄭和平(1962-), 男, 漢族, 教授, 主要從事比較醫學研究, E-mail: zhpfz@163.com