丙烯酰胺對幼年大鼠學習記憶能力的影響及維生素C緩解作用觀察

劉 筱, 徐敬東, 于 放

(1. 北京市十五中學, 北京 100054; 2. 首都醫科大學基礎醫學院生理學與病理生理學系, 北京 100069)

丙烯酰胺對幼年大鼠學習記憶能力的影響及維生素C緩解作用觀察

劉 筱1, 徐敬東2, 于 放1

(1. 北京市十五中學, 北京 100054; 2. 首都醫科大學基礎醫學院生理學與病理生理學系, 北京 100069)

目的觀察丙烯酰胺(ACR)對幼年大鼠學習記憶能力的影響及維生素C對ACR毒性的緩解作用。方法將40只SPF級SD大鼠隨機分為對照組(生理鹽水)和低劑量組(2.5 mg/kg)、高劑量組(10 mg/kg)和ACR+維生素C泡騰片(維生素C組, 10 mg/kg ACR+ 1 mg/kg 維生素C), 每組10只, 雌雄各半。采用灌胃方式進行染毒, 每周染毒5 次, 連續染毒4 周。每周測量大鼠體質量、染毒結束后進行轉棒試驗和水迷宮試驗及大鼠腦組織HE染色。結果與對照組相比，高劑量ACR染毒可引起大鼠體質量減輕(P＜0.05)、轉棒停留時間縮短(P＜0.05)、水迷宮試驗潛伏期延長(P＜0.05)和游泳路程增加(P＜0.05); HE染色提示大鼠海馬組織有損傷; 維生素C組的各項指標好于實驗組。結論ACR可引起幼年大鼠運動功能和學習記憶能力降低，維生素C可在一定程度上減輕ACR的毒性、緩解ACR對大鼠海馬引起的損傷。

丙烯酰胺ACR; 學習記憶; 氧化; 維生素C

丙烯酰胺(acrylamide，ACR)是一種化工原料，廣泛存在于人類的食物和飲用水中。高淀粉食物在高溫烘焙過程中(＞120℃)可以產生ACR，油炸馬鈴薯、咖啡、茶葉都是ACR含量高的食物[1]。研究表明，ACR具有神經毒性、生殖毒性和潛在的致癌性，有一定的蓄積性[2]，ACR的神經毒性顯著影響大鼠的學習記憶能力[3,4]。據調查，薯片、餅干等油炸食品是兒童偏好食品之一，導致兒童攝入ACR的量約為成人 2～3倍[5]。因此，兒童暴露ACR的風險較成年人更高，可能會對兒童造成更大危害。本實驗建立幼年大鼠ACR染毒模型，觀察幼年大鼠成長過程中ACR對其學習記憶力的影響及攝入維生素C是否可以降低ACR神經毒性作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

3周齡SPF級SD大鼠40只，體質量為70～90 g，雌雄各半，由北京維通利華有限公司提供[SCXK(京)2016-0005]，均飼養于首都醫科大學實驗動物部 [SYXK(京) 2013-0005]。

1.2 儀器設備與試劑

ACR(純度為99.9%, CAS: 79-06-1, 北京化學試劑廠, 中國), 采用生理鹽水配制成濃度為2.5g/L的儲存液; 維生素C泡騰片(國藥準字H20056946, 北京拜耳醫藥保健有限公司, 中國), 采用蒸餾水配制成濃度為0.1g/L的儲存液; 水合氯醛(CAS號: 302-17-0, 北京化學試劑廠, 中國); TD6102 型電子天平(金兆市金諾天平儀器有限公司，中國); 大鼠轉棒實驗儀(Ugo Basile，型號：47750，意大利); Morris水迷宮儀(中國醫藥科學院藥物研究所，型號:DNS-2, 中國)。

1.3 大鼠分組與處理

大鼠適應性飼養7 d后隨機分成4組，每組各10只, 雌雄各半, 其中對照組給予生理鹽水; ACR低劑量組, 2.5 mg /kg; ACR高劑量組, 10 mg/kg; ACR高劑量加維生素C泡騰片(簡稱維生素C組)，每日10 mg/kg ACR, 同時給予1 mg/kg維生素C。4組均采用灌胃方式給藥，每周5次, 連續4周, 第6周后采用體積分數10%水合氯醛麻醉處死; 每周測量大鼠的體質量。第5周開始進行運動能力及神經行為學測試。

1.4 外周神經損傷檢測實驗

4組大鼠在灌胃給藥4周后進行轉棒(運動協調性)實驗[6,7]。觀察動物在一定轉速轉棒上的停留時間，推測動物的后肢運動能力，判斷ACR的外周神經毒性作用。第5周時先適應性訓練大鼠站在轉棒上10 min，隨后訓練大鼠在轉速為20 r/min的轉棒上保持平衡，并能持續保持1 min。每日3次，連續5 d。若在此期間墜落在轉棒底部，將受到轉棒下電刺激器的電激懲罰，促使每次實驗中大鼠都能盡最大能力在轉棒上運動。當所有動物達到這一成績后，開始正式測試。第6周正式測試時的轉速20 r/min，每只動物先適應3次后，連續測5次記錄大鼠能夠停留在轉棒上的時間，取其平均值進行統計，每次測試時間為1 min、間隔1 min。

1.5 學習記憶能力的測試

采用Morris水迷宮對動物學習記憶能力進行測試[8]。本實驗采用的Morris 水迷宮儀是一個圓形水池, 直徑180 cm、高55 cm，隱蔽性平臺高30 cm，直徑12 cm。采用視頻追蹤技術記錄大鼠尋找隱藏在水面下平臺的時間(逃避潛伏期, escape latency)和游泳總路程。測試前, 大鼠先被置于不含平臺的水池中自由游泳2次, 熟悉迷宮環境。在定位航行實驗中，將平臺置于第一象限, 將大鼠面向池壁分別從4個入水點放入水中。若大鼠在入水游泳1 min以內未能找到水池中的平臺，引導其至平臺上站立20 s。大鼠爬上平臺休息10 s后將其從平臺上拿下來, 休息1 min以后再進行下一次訓練, 每日于固定時間段訓練4次，連續3 d，記錄每次訓練逃避潛伏期和游泳總路程，取平均值進行統計學分析。第5日撤去平臺，進行空間探索實驗。任選一個入水點將大鼠放入水池中，記錄其在1 min內的游泳軌跡, 考察大鼠對原平臺的記憶。另外, 將平臺置于第三象限(對位臺子)，同樣記錄其在1 min內的游泳軌跡, 考察大鼠的整合記憶能力。第9日進行長期記憶實驗, 將平臺依舊放在第一象限，同樣訓練4次，記錄其平均逃避潛伏期和游泳總路程。

1.6 海馬HE染色

染毒和行為學測試實驗結束后，以10 mL/kg的劑量給予大鼠體積分數10%水合氯醛過量麻醉對大鼠實施安死術后，取出大鼠的腦組織置于質量分數4%多聚甲醛中固定24 h后進行脫水、透明、浸蠟、包埋等步驟得到組織蠟塊, 修整切片為7 μm，經HE染色后光學顯微鏡下觀察海馬組織。

1.7 統計學分析

調查所得數據均錄入Excel 2007 軟件, 采用t檢驗檢查兩組間差異。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 ACR對大鼠體質量的影響

由表1可見，低劑量ACR組SD大鼠的體質量與對照組體質量比較無明顯差異(P＞0.05); 高劑量ACR組大鼠體質量始終低于對照組，至第6周時體質量與對照組達到顯著差異(P＜0.05)。維生素C組體質量與對照組比較沒有顯著差異(P＞0.05)。

2.3 ACR對大鼠運動功能的影響

與對照組比較，雄性及雌性SD大鼠高劑量組在轉棒運動的第2日和第3 日，均顯示出在勻速轉動轉棒上的停留時間降低(P＜0.05, P＜0.01)(表2)，并且雄性組的停留時間(3.00±13.75 s)明顯短于雌性組(26.50±18.35 s, P＜0.05); 維生素C組在勻速轉動轉棒上的停留時間也出現性別差異，雌性SD大鼠與高劑量組比較僅在第2日出現轉棒上停留時間增加的趨勢(P＞0.05); 而在雄性維生素C組，與高劑量組比較，在第2日和第3 日均顯示出停留時間顯著增加(P＜0.05)。

表 1 不同劑量丙烯酰胺及維生素C攝入對大鼠體質量的影響Table 1 Effects of different doses of acrylamide and vitamin C on the rats weight g

2.4 ACR對大鼠學習記憶功能的影響

結果表明(表3)，低劑量組SD大鼠上岸潛伏期及游泳距離與對照組相比無明顯差異，高劑量組SD大鼠在第2日、第5日(空間探索)、第5日(對位臺子)及第九日均表現出上岸潛伏期、游泳距離較對照組顯著增加(P＜0.05)。第3日及第9日，維生素C組的上岸潛伏期和游泳距離均較高劑量組低(P＜0.05)，但仍高于對照組(P＜0.05)。

表 2 不同劑量丙烯酰胺及維生素C攝入對大鼠運動功能的影響Table 2 Effects of different doses of acrylamide and vitamin C on motor function in rat s

表 3 不同劑量丙烯酰胺及維生素C攝入對大鼠水迷宮逃避潛伏期和游泳距離的影響Table 3 Effects of different doses of acrylamide and vitamin C on the latency and the swimming distance in MWM

2.5 ACR對大鼠海馬的損傷

從圖1可見，對照組、低劑量、高劑量以及維生素C組的大鼠海馬的齒狀回(dentate gyrus, DG)區形態類似，CA1區細胞排列緊密，形態完整，細胞核飽滿、核仁清晰，然而在高劑量組CA1區明顯出現細胞排列疏松、紊亂、細胞形態不規則，胞膜皺縮、胞核固縮、破裂、濃染，甚至出現核仁模糊或消失。低劑量及維生素C組CA1區與對照組差異不明顯。

3 討論

3.1 ACR神經毒性的發病機制

ACR是神經蓄積性毒物，急性或亞急性損害以中樞神經系統及小腦功能障礙為主，慢性中毒以周圍神經損害為主[9]。本文結果表明，高劑量ACR染毒4周后，與對照組相比，大鼠體質量下降，周圍神經損害明顯，運動功能受損。據文獻[10-12]報道，ACR進入人體后，在肝臟細胞色素P450的作用下，生成活性環氧丙烯酰胺，與ACR和血紅蛋白結合形成加合物，聚集在神經、肝、腎及生殖系統中。另外，ACR與驅動蛋白、動力蛋白巰基相結合, 抑制軸漿轉運的有關酶類, 從而抑制神經生長因子等的轉運, 導致髓鞘變性、脫失[13-15]。此外，大鼠在ACR染毒后，腦和肝中的超氧化物歧化酶活性下降，脂質過氧化增強[16]; 高濃度的ACR可通過增加細胞內活性氧簇的水平，誘導神經前體細胞的凋亡和壞死，導致神經前體細胞的增殖明顯減少，這些提示氧化損傷可能是ACR神經毒性的重要發病機制。因此本實驗在ACR暴露的同時給予抗氧化劑維生素C，結果表明維生素C能在一定程度上緩解ACR毒性，降低損傷。

3.2 ACR可通過損傷海馬引起大鼠學習記憶能力下降

圖 1 HE染色觀察ACR對大鼠海馬的損傷作用及維生素C的保護作用 (HE×100, 標尺: 100 μm)Figure 1 The effect of acrylamide on rat hippocampal injury and the protective effect of vitamin C by HE staining(HE×100, scale: 100 μm)

有研究[17]觀察到ACR中毒后大鼠大腦皮層、小腦、海馬及視丘等出現多發部位損害，海馬，屬大腦邊緣系統，與學習記憶關系密切。大鼠海馬通常由CA1、CA3和CA4區組成，CA4區有齒狀回(DG)的多形層。研究[18]表明，海馬CA1區錐體神經元對缺血性損傷十分敏感，CA3區和DG區則對缺血性刺激相對耐受，反應出CA1區是易損區。本文結果顯示，ACR的長期蓄積引起SD大鼠海馬組織CA1區的損傷，出現顆粒細胞層數明顯減少、細胞排列紊亂、細胞形態改變及細胞核固縮，因此本文作者認為，高劑量的ACR可能直接損傷海馬組織，進而影響了大鼠學習記憶能力。Morris水迷宮實驗證實, 高劑量組SD大鼠的短期記憶及長期記憶均受到影響，表現為逃避潛伏期及游泳總路程較對照組明顯增加, 這也證明ACR對幼年大鼠記憶力的影響可能是通過損傷CA1區發生的。

3.3 維生素C一定程度上控制了大鼠的ACR毒性

天然維生素C 廣泛存在于新鮮水果和綠色蔬菜中，在體內可直接參與氧化還原反應或間接還原其它抗氧化系統，是重要的水溶性強抗氧化劑。本文結果表明，維生素C組與高劑量組相比, 長期記憶的潛伏期縮短，但仍長于對照組。說明1 mg/kg的維生素C一定程度上緩解了ACR對SD大鼠的海馬損傷，但并未扭轉或徹底清除毒性作用。維生素C可能通過清除自由基減輕ACR的神經毒性，對腦組織有保護作用，其具體機制有待進一步闡明。

本文結果提示，人類應該盡可能避免攝入高ACR食品，經常攝入高ACR食品的人群盡可能搭配高維生素C食品，以降低其危害。

(致謝: 感謝首都醫科大學實驗動物中心提供我們實驗的場所; 感謝首都醫科大學公衛學院余煥玲教授、實驗動物學系杜小燕副教授給予論文的指導及英文撰寫的幫助；感謝首都醫科大學解剖教研室楊春副教授給予大鼠腦HE染色的指導與幫助。)

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Effects of Acrylamide on Learning and Memory Ability in Young Rats and Toxicity Alleviation by Vitamin C

LIU Xiao1, XU Jing-dong2, YU Fang1
(1. Beijing 15 Middle School, Beijing 100054, China; 2. Department of Physiology and Pathophysiology,School of Basic Medical Sciences, The Capital Medical University, Beijing 100069, China)

ObjectiveTo study the effects of acrylamide on learning and memory ability in young rats and alleviated effect of vitamin C.MethodsForty SPF grade SD rats weighing 70-90 g were randomly divided into four groups, 10 in each group and male and female in half. The control groups were given normal saline. The rats in experimental groups were given acrylamide dissolved in normal saline,at the doses of 2.5 mg/kg, 10 mg/kg and vitamin C group was given 10 mg/kg and 1 mg/kg vitamin at the same time. All animals were given test substances through oral gavage, 5 days/week, for 4 weeks. Body weight was measured per week. Special tests included the rotarod Test and the staining of rat brain tissue. Learning and memory ability was tested by Morris water maze (MWM).ResultsCompared with the control group, the weight of rats in high-dose group treated with acrylamide was decreased(P＜0.05) and time for rats standing rotarod was decreased (P＜0.05) and the latency was extended and the distance was increased by Morris water maze (MWM); The HE staining suggested that the hippocampal tissue of rats was damaged. The indexes of vitamin C group were better than the experimental groups.ConclusionAcrylamide can damage motor function and learning-memory capability in young rats and vitamin C can decrease the ACR toxicity and alleviate the hippocampal tissue damage in some degree.

Acrylamide; Learning and memory; Oxidation; Vitamin C

Q95-33

A

1674-5817(2017)06-0460-05

10.3969/j.issn.1674-5817.2017.06.007

2017-08-10

劉 筱(2000-), 女, 北京市十五中學在校高中學生。E-mail: kongluxinxiang@ sina.com

于 放(1973-), 男, 碩士, 講師。研究方向: 生物學。 E-mail: 13701063432@ 139.com