實驗用斑馬魚成魚內臟組織病理學檢查方法的優化

田 芳, 王玉柱, 夏敏杰, 孫 冰, 丁訓城, 李衛華, 許慧慧, 胡晶瑩

(1. 上海市計劃生育科學研究所, 國家計劃生育藥具重點實驗室, 上海 200032;2. 上海市疾病預防控制中心, 上海 200336)

實驗用斑馬魚成魚內臟組織病理學檢查方法的優化

田 芳1, 王玉柱1, 夏敏杰1, 孫 冰1, 丁訓城1, 李衛華1, 許慧慧2, 胡晶瑩1

(1. 上海市計劃生育科學研究所, 國家計劃生育藥具重點實驗室, 上海 200032;2. 上海市疾病預防控制中心, 上海 200336)

目的探索并優化適合于斑馬魚成魚內臟組織的病理學檢查技術。方法將斑馬魚整條固定于Dietrich’s固定液后，分段切開，取包含內臟組織的胸腹段，剝除斑馬魚魚皮，梯度乙醇脫水時間優選為30 min、二甲苯透明、石蠟包埋、沿斑馬魚體軸縱向連續切片、HE染色后用溫水沖洗切片進行顏色反藍，正置顯微鏡下觀察效果。結果經過反復的條件摸索和優化，光學顯微鏡下觀察心臟、肝臟、脾臟、膽囊、腎臟、胰腺、消化道、精巢和卵巢等組織切片和染色的效果，可見斑馬魚組織均切片完整，無折疊或斷裂，各臟器的解剖學與組織細胞學結構清晰，易于辨認，細胞核與細胞質染色分明。結論優化后的斑馬魚成魚內臟組織病理學方法效果較為理想，可獲得高質量的內臟組織學標本。

斑馬魚; 內臟組織; 連續切片; HE染色

斑馬魚(Zebrafish, Danio rerio)是小型熱帶硬骨淡水魚，具有繁殖能力強、性成熟周期短、胚胎透明、個體小、易于養殖等優點。近年來，斑馬魚作為實驗模式生物，已被廣泛運用于環境毒理學、發育生物學等研究領域[1,2]。

在開展斑馬魚研究工作中, 高質量的組織病理學檢查是必不可少的一項實驗技術, 包括斑馬魚胚胎以及成魚心臟、肝臟、脾臟、腎臟和性腺(包括精巢和卵巢)等內臟組織的病理切片及染色觀察[3-10]。在斑馬魚研究的經典技術用書《The Zebrafish Book》[11]中，主要描述了幼魚和胚胎的組織學實驗方法，對斑馬魚成魚的組織病理切片實驗方法并未進行詳細闡述。由于斑馬魚的臟器非常小，結構性質也與常用哺乳類動物有區別，因此在病理學檢查實踐中經常出現切片和染色效果差的情況，無法滿足研究需求。

本研究在現有斑馬魚組織切片染色方法的基礎上[12,13]，進行了條件摸索和優化，旨在探索一種較為理想的斑馬魚成魚內臟組織病理學實驗方法，為開展斑馬魚研究工作的同行提供技術參考。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

成年野生型(AB系)斑馬魚購自國際斑馬魚研究中心(俄勒岡州立大學)，體長3～4 cm，分別選取雌雄斑馬魚各5條。

1.2 試劑與儀器

Dietrich’s固定液[11](實驗室配制, 配方: 體積分數100%乙醇300 mL, 冰醋酸20 mL, 甲醛100 mL，蒸餾水580 mL, 混勻封口); 二甲苯(國藥集團化學試劑有限公司); 無水乙醇(國藥集團化學試劑有限公司); 體積分數95%乙醇(上海實驗試劑有限公司); 體積分數75%乙醇(上海實驗試劑有限公司); Harris蘇木素染色液(德國Carl Roth GmbH Co. KG); 伊紅(國藥集團化學試劑有限公司); 中性樹膠(國藥集團化學試劑有限公司); Leica RM2235石蠟切片機(德國萊卡公司); Olympus BX43型生物顯微鏡(日本奧林巴斯株式會社)，Leica DFC425彩色數碼攝像機(德國萊卡公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 切片標本制作方法斑馬魚在Dietrich’s固定液固定72 h，如圖1橫切分成頭段、胸腹段和臀段，取胸腹段自來水沖洗30 min 后，將斑馬魚魚皮剝除，進行脫水、透明和浸蠟，具體步驟: 體積分數75%乙醇30 min; 體積分數85%乙醇30 min;體積分數95%乙醇30 min; 100%乙醇(Ⅰ)30 min;100%乙醇(Ⅱ)30 min; 100%乙醇: 二甲苯(1∶1)10 min; 二甲苯(Ⅰ)至組織半透明; 二甲苯(Ⅱ)組織全透明; 二甲苯: 石蠟(1∶1) 10 min; 石蠟(Ⅰ)60 min;石蠟(Ⅱ)60 min; 石蠟(Ⅲ) 60 min, 斑馬魚一側胸腹段平行于蠟模底部包埋, 蠟塊凝固后，沿斑馬魚體軸縱向連續切片，切至內臟部分開始用載玻片收集組織切片, 直至背側中線脊椎處，切片厚度為5 μm。

圖 1 斑馬魚分段切開示意圖

1.3.2 連續切片HE染色步驟 切片烘干后，進行脫蠟，水化，染色，脫水，透明，封片。具體步驟為: 二甲苯(Ⅰ)10 min，二甲苯(Ⅱ)10 min，二甲苯(Ⅲ) 10 min, 體積分數100%乙醇(Ⅰ)3 min，體積分數100%乙醇(Ⅱ) 3 min，體積分數95%乙醇 2 min，體積分數85%乙醇2 min，體積分數75%乙醇2 min，雙蒸水1 min，Harris蘇木素染色液1.5 min，溫水沖洗7 min，雙蒸水1 min，體積分數95%乙醇1 min, 伊紅染色液1 min, 體積分數75%乙醇30 s，體積分數85%乙醇1 min，體積分數95%乙醇 (Ⅰ) 2 min，體積分數95%乙醇(Ⅱ)2 min，體積分數100%乙醇(Ⅰ) 3 min，體積分數100%乙醇(Ⅱ)3 min，二甲苯(Ⅰ)2 min，二甲苯(Ⅱ) 2 min，二甲苯(Ⅲ) 2 min，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察并拍照。

1.3.3 標本制作方法改進 經過反復的條件摸索和優化，確定了四點改進方法。首先，胸腹段脫水前先將固定后的斑馬魚魚皮剝除，這一步驟對觀察后面的透明過程非常重要; 其次，沿斑馬魚體軸縱向連續切片，直至背側中線脊椎處，切至內臟部分開始用載玻片收集組織切片; 再次，根據剝皮后斑馬魚二甲苯透明程度，摸索最佳脫水時間，梯度乙醇脫水時間優化為30 min; 最后，HE染色后用溫水沖洗切片進行顏色反藍。

2 結果

采用優化的方法制作斑馬魚成魚內臟組織連續切片和染色，顯微鏡下分別觀察心臟、肝臟、脾臟、膽囊、腎臟、胰腺、消化道及雌雄斑馬魚性腺(精巢和卵巢)，結果見圖2。圖2J為部分斑馬魚鰓沒有全部切除，組織切片染色的結果。

從圖中可以可到斑馬魚組織均切片完整，無折疊或裂開，組織細胞核藍染，細胞質紅染區分明顯，不同內臟組織解剖學和細胞學特點清晰，沒有出現組織脆裂或收縮。

3 討論

與哺乳類動物相比，斑馬魚體積較小，內臟臟器非常集中，主要在胸腹段，包括心臟、肝臟、脾臟、腎臟、消化道及性腺等組織和器官，有研究者采用固定前取出各內臟臟器和組織進行固定、包埋和切片[10,13]，但因為斑馬魚內臟臟器比較小，新鮮取材時容易對組織造成物理損傷，切片的組織學形態也會改變。本實驗采用整魚固定后連續切片，可最大程度保持斑馬魚內臟各臟器的組織形態，包埋切片后，染色顯示各臟器細胞學特點明顯，結合解剖學大致定位，有利于對各臟器組織進行病理學研究。斑馬魚內臟組織病理學研究必須依據清晰高質量的臟器組織染色切片，因此，成功的連續切片標本制作是關鍵，包括固定、脫水、透明、包埋、切片和染色。若脫水不充分，無法進行后面的透明和浸蠟; 二甲苯沒有完全置換乙醇，組織內也不能充滿石蠟，都不能順利切片。相反，乙醇處理時間太長，容易引起組織收縮; 二甲苯透明處理時間過長，則會引起組織脆裂, 因此,每個步驟都需要反復摸索和優化。

圖 2 斑馬魚內臟器官組織學觀察

斑馬魚固定時保證魚體的平展, 避免彎曲, 為保證內臟器官完整，進行分段時垂直于體軸，分別在鰓蓋后方和臀鰭前平泄殖孔處橫切，將斑馬魚分為頭段、胸腹段和臀段，取胸腹段制作連續切片標本，可以觀察到完整的內臟器官。鰓作為斑馬魚的呼吸器官，可通過觀察病理組織變化評價其呼吸機能[10,14], 本實驗顯示部分鰓沒有完全切除的斑馬魚，通過本方法得到的斑馬魚鰓組織切片無折疊或裂開，所以評價目的器官為斑馬魚鰓時，可以考慮分段時在鰓蓋前方橫切，后續采用本方法包埋切片, 染色后也可以清晰觀察斑馬魚鰓組織學變化。

因為斑馬魚體側具有像斑馬一樣的暗藍與銀色相間的條紋，本研究預實驗表明二甲苯透明過程因魚皮反射光線，不能觀察透明程度，因此考慮將魚皮剝除。首先嘗試了新鮮斑馬魚剝皮，但難度大，并且具有牽拉過程傷及內臟，因此改為固定后對斑馬魚進行剝皮，比較容易完成，而且有利于保持內臟組織形態。

固定后斑馬魚進行脫水，根據剝皮后斑馬魚二甲苯透明程度，摸索最佳脫水時間，本實驗設計梯度乙醇脫水時間分別設為：10 min、30 min、45 min，結果顯示脫水30 min和45 min組織透明均較為理想，考慮節約時間，梯度乙醇脫水時間優化為30 min。

HE染色過程也要注意: 首先，染色前將蘇木素染色液過濾，二甲苯和梯度乙醇保持新鮮; 其次，蘇木素染色后，用溫水(40 ℃左右)沖洗切片進行顏色反藍。通過優化制作方法，制作出的斑馬魚連續切片標本，各臟器組織染色效果好，可以清晰觀察各組織結構和細胞學特點。

綜上所述，本研究通過反復摸索，優化了斑馬魚成魚內臟組織病理學標本制作和染色方法，效果較為理想。針對已有斑馬魚成年連續切片方法文獻在操作細節上進行進一步細化和完善，補充并豐富了不同組織臟器的HE染色圖片[12]。

本研究為獲得高質量的斑馬魚內臟組織病理學標本提供了一種方法，希望能為開展斑馬魚研究工作的同行們提供技術參考。

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Optimization on Methodology of Histopathological Examination in Adult Zebrafish Visceral Tissues

TIAN Fang1, WANG Yu-zhu1, XIA Min-jie1, SUN Bing1,DING Xun-cheng1, LI Wei-hua1, XU Hui-hui2, HU Jing-ying1
(1. State Key Labs of Family Planning Devices, Shanghai Institute of Planned Parenthood Research, Shanghai 200032, China; 2. Shanghai Municipal Center For Disease Control & Prevention, Shanghai 200336, China)

ObjectiveTo explore the optimized method of paraffin serial section and hematoxylineosin (HE) staining of the adult zebrafish visceral tissues.MethodsAfter the zebrafish was fixed, the tissues were segmented, and the thoracic/abdominal segment which contains internal organs was stripped of skin and dehydrated by gradient ethanol (dehydration time was optimized to 30 min), transparented by xylene and embedded by paraffin. The tissue was sectioned serially along the body axis, rinsed with warm water after HE staining, and observed under microscope.ResultsThe microscopic observation of heart, liver, spleen, gallbladder, kidney, pancreas, gastrointestinal tract, testis and ovary showed that effects of tissue sectioning and staining were favorable. The sections were intact without collapse or fracture, the anatomical and cytological structure of all organs were clear and complete, the nucleus were neatly blue-stained and the cytoplasm were neatly red-stained.ConclusionWith the optimized histopathological method, we were able to obtain high quality histological specimens of the internal organs of adult zebrafish.

Zebrafish; Visceral tissue; Serial section; Hematoxylin-eosin (HE) staining

R332 Q95-33

A

1674-5817(2017)06-0465-05

10.3969/j.issn.1674-5817.2017.06.008

2017-05-10

上海市科委實驗動物研究專項(15140901200); 上海市第四輪公共衛生三年行動計劃重點學科建設計劃—環境衛生學與勞動衛生學(15GWZK0201);上海市青年科技英才揚帆計劃(15YF1410000)

田 芳(1985-), 女, 碩士, 助理研究員, 生殖毒理學方向。E-mail: 376616808@qq.com

胡晶瑩, 女, 博士, 助理研究員, 生殖毒理方向。

E-mail: hujingying@aliyun.com;

許慧慧, 女, 碩士, 主任醫師, 環境衛生方向。E-mail: xuhuihui@scdc.sh.cn.