乙草胺降解菌L3的促生物質

閆志宇+翟蓓蓓+李術娜+李紅亞+王全

摘要： 為探明乙草胺降解菌枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）菌株L3的促生功能。以嗜鐵素、吲哚乙酸和小分子有機酸（包括甲酸、乙酸、乳酸等）為檢測指標，應用平皿生化反應與薄層色譜法對供試菌株的發(fā)酵液進行促生物質的定性檢測，并使用光度法對嗜鐵素和吲哚乙酸進行定量測定，最后利用特異性顏色反應對菌株所產嗜鐵素類型進行鑒定。結果表明，菌株L3可產生嗜鐵素，其D680 nm/D680 nm（r）值為0.610，為羧酸型；菌株可產生吲哚乙酸，在LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)36 h，其發(fā)酵液中吲哚乙酸濃度為75.6 mg/L；應用薄層色譜法檢出菌株可產生小分子有機酸，但不能明確種類。研究結果明確了乙草胺降解菌L3的促生功能，證實L3菌株除了可用于修復乙草胺污染的土壤外，還具有多方面的應用價值。

關鍵詞： 乙草胺降解菌；枯草芽孢桿菌；嗜鐵素；吲哚乙酸；小分子有機酸；促生物質

中圖分類號： X172 文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2017）22-0295-04

近年來，土壤生態(tài)系統(tǒng)不斷遭到破壞，一方面各種農藥的過量或不恰當施用導致土壤中農藥殘留不斷增多，進而引發(fā)糧食、蔬菜等安全問題；另一方面，化肥使用量逐年增加，造成土壤板結，肥力下降，農產品減產減質嚴重。面對日趨嚴峻的土壤惡化形勢，科學家和政府職能部門均在采用各種措施減輕土壤所受的污染，并尋求新的增產措施。

乙草胺是一種廣譜、高效的內吸性酰胺類除草劑，需在芽前施用于土壤中[1]。我國自1982年研制成功乙草胺并投入使用后，乙草胺一直是我國生產量和用量最大的三大除草劑之一，過量、頻繁地施用乙草胺或施用不當已造成嚴重的土壤污染，加上乙草胺已被美國環(huán)保局定為B2類致癌物，其降解問題已倍受關注[2-3]。筆者所在研究室前期篩選到1株乙草胺降解菌株L3，在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中培養(yǎng)48 h后對乙草胺的降解率為52.0%，經鑒定為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）。據報道，枯草芽孢桿菌可通過分泌嗜鐵素、吲哚乙酸、抗菌蛋白、抗生素等不同物質促進植物的生長，加上其在工業(yè)生產中的優(yōu)勢，對其促生應用功能的研究正成為當下的熱點[4]。本研究在此基礎上進一步考察降解菌株的促生功能，探明此菌株對解決土壤問題的綜合潛力與可行性，以期為該菌株的實際應用奠定基礎。

目前對乙草胺降解菌的研究大多集中于降解菌的篩選、降解特性研究及降解途徑的分析方面，對降解菌的多功能發(fā)揮探究尚未見報道[5-11]。而在促生菌研究方面，目前研究較深入的是假單胞菌屬和芽孢桿菌屬，其中，枯草芽孢桿菌在促生方面的研究已有報道，但大多數研究集中于通過盆栽試驗明確其對植物的增產增質效果[12-15]。在對枯草芽孢桿菌促生物質的種類及產量研究中，易有金等明確了枯草芽孢桿菌可產生或誘導產生吲哚乙酸、赤霉素和玉米素核苷等促生物質[16-17]。余賢美等篩選獲得的枯草芽孢桿菌CAS15和 Bs-15 均可產生促生物質嗜鐵素[18-19]。

對乙草胺降解菌枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）菌株L3進行盆栽試驗時發(fā)現，該菌株除對乙草胺具有較高的降解率（7 d后對土壤中乙草胺的降解率為34.93%）外，還對土壤中因乙草胺的施入而降低的一些酶和營養(yǎng)元素具有一定的修復作用，且對小麥的生長產生了積極的促進作用，推測乙草胺降解菌L3可能產生了某些促進植物生長的物質[20]。因此，本試驗選取目前研究最為廣泛的幾種促生物質，即嗜鐵素、吲哚乙酸和一些小分子有機酸作為檢測對象，探討菌株L3是否可以產生此類物質，進而明確其在土壤修復與農業(yè)增收增產中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

乙草胺降解菌菌株L3，由筆者所在實驗室分離保存。

1.1.2 培養(yǎng)基和染液

NA培養(yǎng)基，用于L3的活化及保藏。

LB液體培養(yǎng)基，用于菌株發(fā)酵與產嗜鐵素的定量檢測。

鉻天青（簡稱CAS）定性檢測培養(yǎng)基：參考Schwyn等的檢測方法[21-23]，將CAS平板進行改進，改進處如下：

取0.023 g十六烷基三甲基溴化銨加入8 mL蒸餾水中，得液體a；取0.018 g CAS溶于10 mL雙蒸水中，并與3 mL 1 mmol/L FeCl3溶液混勻，得溶液b；然后將溶液a和b混勻，即得染液c。向100 mL雙蒸水中加入4.95 g磷酸氫二鈉和5.10 g磷酸二氫鈉，將配制好的磷酸緩沖液用蒸餾水稀釋 8.5 倍，后取170 mL放入三角瓶中，然后滴入少量的 12 mol/L NaOH使pH值降到5.9，向上述三角瓶中添加3.2 g瓊脂粉，為培養(yǎng)基d。其他操作參照文獻[22]。該培養(yǎng)基用于菌株產嗜鐵素的定性檢測。

0.5%溴甲酚綠培養(yǎng)基，用于菌株產吲哚乙酸和小分子有機酸的定性檢測。

CAS檢測液的制備參照文獻[22]；以溴甲酚綠為指示劑，顯色范圍為3.8～5.4（黃～藍）；以對二甲氨基苯甲醛為顯色劑。

1.2 方法

1.2.1 菌株L3產嗜鐵素能力研究

在CAS定性檢測培養(yǎng)基上打孔，將培養(yǎng)48 h的L3發(fā)酵液經φ0.45 μm濾膜除去菌體后，取上清液100 μL注入小孔內，另將未接菌的LB液體培養(yǎng)基經上述相同處理后注入孔內作為對照，在37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后觀察小孔周圍顏色的變化情況，以確定菌株L3產嗜鐵素的能力。

將培養(yǎng)48 h的L3發(fā)酵液于8 000 r/min離心10 min，取 3 mL 上清液加入3 mL CAS檢測液中，充分混勻[23]。靜置 1 h 后采用分光光度法測定其在波長680 nm下的吸光度，以蒸餾水調零，以未接菌、經相同處理的LB液體培養(yǎng)基的吸光度作為本試驗的參比值[簡稱D680 nm（r）[23]。endprint

為確定菌株L3所產嗜鐵素的結構類型，將培養(yǎng)48 h的L3發(fā)酵液作如下處理：兒茶酚型嗜鐵素檢測采用Arnows試驗[24]；異羥肟酸型嗜鐵素檢測采用FeCl3試驗[25]；羧酸型嗜鐵素檢測采用Shenkers試驗[26]。

1.2.2 菌株L3產吲哚乙酸能力研究

在0.5%溴甲酚綠培養(yǎng)基上打孔，將培養(yǎng)48 h的L3發(fā)酵液經φ0.45 μm濾膜除去菌體后，取上清液100 μL注入小孔內，另將未接菌的LB液體培養(yǎng)基經上述相同處理后注入孔內，作為對照，在37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，48 h后觀察小孔周圍顏色的變化情況，初步判定菌株L3產吲哚乙酸的情況。

利用薄層層析法進一步鑒定菌株L3產吲哚乙酸的能力。制作濃度為30%的硅膠層析板，用等體積乙酸乙酯萃取菌株L3培養(yǎng)48 h的發(fā)酵液，將上層有機溶劑倒入圓底燒瓶中旋轉蒸發(fā)濃縮樣品，干燥后的粉末倒入燒杯中，加入5 mL甲醇溶解；設置未接L3菌株的對照組，與試驗組進行相同處理。用0.5 mm毛細管蘸取吲哚乙酸標準品點樣，并取試驗樣品和對照樣品依次點樣2個，以體積比5 ∶ 1的三氯甲烷、甲醇為展開劑，晾干后用對二甲氨基苯甲醛顯色劑顯色。

對吲哚乙酸進行定量測定，制作吲哚乙酸標準曲線：向 5 mL 甲醇中加入5.0 mg吲哚乙酸標準品，充分溶解后配成終濃度為1 mg/mL的吲哚乙酸母液。分別取0.05、0.10、0.20、0.40、0.80、1.60 mL上述母液，用甲醇定容至20 mL。搖勻后在280 nm波長處測定各自的吸光度，以甲醇為對照調零。取培養(yǎng)至24、36、48 h的發(fā)酵液，經乙酸乙酯萃取濃縮后置于4支1.5 mL的離心管中，8 000 r/min離心10 min，取上清液用甲醇溶液稀釋200倍后加入比色皿中，分別測其在280 nm波長處的吸光度，以甲醇溶液為對照調零。根據吲哚乙酸的標準曲線計算樣品的產物濃度。

1.2.3 菌株L3產小分子有機酸的能力研究

利用薄層層析法定性判定菌株是否能產小分子有機酸及其種類。制備菌株L3的發(fā)酵液，設置不接菌對照組，37 ℃、180 r/min培養(yǎng)48 h。用與吲哚乙酸同樣的方法對試驗組和對照組進行萃取濃縮。分別在5支1.5 mL離心管中加入0.2 mL甲酸、乙酸、乳酸、蘋果酸、丙酸、正丁酸溶液，加入0.8 mL甲醇溶液搖勻以配制各小分子有機酸的標準液，并各取少量（等量）混勻。用 0.5 mm 毛細管蘸取標準酸混合液及濃縮樣品液、對照液依次點樣于薄層板，以體積比5 ∶ 4 ∶ 1的三氯甲烷、乙酸乙酯、甲酸為展開劑，將展開后的薄層板在通風處晾置12 h后，用溴甲酚綠顯色劑顯色。

2 結果與分析

2.1 菌株L3產嗜鐵素的能力研究

CAS定性檢測培養(yǎng)基呈天藍色固態(tài)，由于嗜鐵素是強鐵螯合劑，可競爭培養(yǎng)基中與乙二胺四乙酸（EDTA）螯合的鐵離子，使培養(yǎng)基由藍色變成黃色，因此菌落周圍黃色暈圈的大小可代表嗜鐵素的產量[12]。觀察培養(yǎng)48 h后的培養(yǎng)基，與對照孔相比，注入L3發(fā)酵液小孔周圍的橘黃色暈圈現象明顯，見圖1。因此可知菌株L3可以產生嗜鐵素。

經測定，在波長680 nm下，各處理的吸光度見表1。菌株L3 D680 nm均值為0.603，參比組均值為0.988，D680 nm/D680 nm（r）比值為0.603/0.988=0.610。D680 nm/D680 nm（r）比值作為定量指標，比較各種微生物嗜鐵素的產量，D680 nm/D680 nm（r）比值越小，反映嗜鐵素的產量越大。

在嗜鐵素類型檢測反應中，菌株L3的發(fā)酵液在兒茶酚型嗜鐵素檢測和異羥肟酸型檢測試驗所規(guī)定的波長中均沒有吸收峰；而在羧酸型嗜鐵素檢測中，其發(fā)酵液上清與檢測液反應，在240～280 nm范圍內有明顯的吸收峰（圖2），表明菌株L3產生的嗜鐵素為羧酸型。

2.2 菌株L3產吲哚乙酸能力研究

溴甲酚綠的變色pH值范圍為3.8～5.4，顏色變化為黃色～藍色；本研究的溴甲酚綠培養(yǎng)基為偏中性，呈藍色，如菌株發(fā)酵液中含有吲哚乙酸，則導致孔周圍呈弱酸性，該范圍培養(yǎng)基中的溴甲酚綠變?yōu)辄S綠色。圖3所示為菌株培養(yǎng)48 h后發(fā)酵液所造成的顏色變化情況。由圖3可見，與對照孔相比，L3發(fā)酵液孔周圍培養(yǎng)基趨近黃綠色，說明菌株L3可產生一定量的吲哚乙酸。

對該菌株發(fā)酵液用硅膠薄層色譜法進行進一步檢測，根據吲哚類物質遇對二甲氨基苯甲醛顯示玫瑰紅色的特性來定性檢測發(fā)酵液中的吲哚乙酸。48 h后發(fā)酵液的薄層色譜結果見圖4，表明菌株L3發(fā)酵液含有吲哚乙酸。

通過紫外分光光度法測定不同濃度標準吲哚乙酸的吸光度，得出吲哚乙酸的標準曲線為y=0.019 8x+0.026 2，r2=0.997 6。經檢測計算，不同發(fā)酵時間下菌株L3發(fā)酵液D280 nm及對應的吲哚乙酸含量見表2。

根據表2可知，培養(yǎng)36 h的發(fā)酵液中吲哚乙酸含量最高，而48 h時含量有所下降，推測可能是菌株所分泌的吲哚乙酸參與后期菌株代謝而被利用消耗了。

2.3 菌株L3產小分子有機酸能力研究

為明確發(fā)酵液中是否含有小分子有機酸及其類型，采用硅膠薄層色譜法進行進一步的定性檢測，用酸堿指示劑溴甲酚綠為顯色劑。經多次比較試驗，考慮菌株在發(fā)酵過程中可能產生的一種或幾種小分子有機酸較微量，不便于分別檢出，故將各標準酸液混勻使用，并對發(fā)酵液進行充分濃縮，所得薄層色譜結果見圖5。如圖5所示，小分子有機酸標準品混合液在薄層板上形成綠色區(qū)域，菌株L3發(fā)酵液在相應水平面上同樣出現該變色區(qū)域，而對照組中只出現略微斑跡，可能是受到展開劑影響。此結果雖未能確定所產有機酸的種類，但可說明菌株L3發(fā)酵液中的確有小分子有機酸產生。

3 結論與討論

已報道的菌株嗜鐵素產量各不相同，較高的如韓松等篩選的芽孢桿菌，樣品D680 nm的D/Dr值約為0.2[27]；梁建根等篩選出的杭州地區(qū)黃瓜猝倒病菌產嗜鐵素拮抗菌HZX-25與HZD-8，其D/Dr值分別為0.62、0.61[28]；余賢美分離獲得的枯草芽孢桿菌CAS15，其D510 nm/D600 nm值為0.10～039。本試驗中枯草芽孢桿菌L3所產嗜鐵素其D/Dr值為0.61，產量比較理想[19]。endprint

前人所獲菌株的吲哚乙酸產量從0.152～148.800 mg/L大小不等[29-31]。菌株L3培養(yǎng)至36 h時發(fā)酵液中吲哚乙酸濃度可達75.6 mg/L。據報道，吲哚乙酸對植物正常生長的作用通常是低濃度可促進生長，濃度稍高時即起抑制生長的作用，更高濃度即對植物有傷害作用[32]。不過不同作物對吲哚乙酸濃度的敏感性不同[33]。

有機酸不僅是植物碳代謝的中間體，而且在應對養(yǎng)分缺乏、金屬脅迫以及根-土界面植物-微生物間交互作用方面都發(fā)揮著關鍵作用[34]。且低濃度有機酸對作物的生長有明顯的調節(jié)，可提高作物的抗逆性[35]。新的活性有機酸和有機酸鹽的發(fā)現會成為調節(jié)植物生長過程的重要研究課題。在本研究中，并沒有確切檢驗出菌株L3產生小分子有機酸的類型，由于小分子有機酸在產生之后便迅速進入菌株的物質代謝循環(huán)，被微生物再利用，故須要采用其他更靈敏準確的定性定量檢測方法如高效液相色譜法、氣相色譜法和離子交換色譜法等。

本試驗僅對菌株檢測了少量促生物質，但具有促生長作用的物質還有很多，如植物細胞分裂素（簡稱CTK）[36]、氨基環(huán)丙烷羧酸（簡稱ACC）脫氨酶[29]、其他有機酸（包括腐殖酸、低分子酸）[37]和某些抗生素等。菌株L3也可能潛在地分泌其他類型的促生物質，有待試驗的進一步加強和驗證。

試驗最終探明菌株L3可產生一定量的嗜鐵素、吲哚乙酸、小分子有機酸，基本明確了菌株L3的促生作用。菌株L3所產嗜鐵素其D/Dr值為0.610，全部為羧酸型；36 h時菌株L3發(fā)酵液中吲哚乙酸的濃度為75.6 mg/L；經與文獻數據比對可知，菌株L3有較強的促生能力。

本試驗證實菌株L3除可降解除草劑乙草胺外，兼有促進植物生長能力，且L3屬枯草芽孢桿菌，由于芽孢桿菌具有利于實現工業(yè)化生產、倉儲期長、活性不易衰退，且施用于土壤中更易適應環(huán)境、生存定值與功能發(fā)揮等特點，使其具有更廣泛的應用前景和更大的應用價值。本研究為單一菌劑在受損土壤的多方修復應用方面提供了理論指導。

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