抗CD137L單抗對再生障礙性貧血T細(xì)胞亞群及細(xì)胞因子誘生水平的影響及意義

王志敏，潘學(xué)霞，李尊昌，王雨存，王立盼

（1. 濱州市人民醫(yī)院血液內(nèi)科；2. 兒科；3. 風(fēng)濕免疫科，山東 濱州 256600）

檢驗論著

抗CD137L單抗對再生障礙性貧血T細(xì)胞亞群及細(xì)胞因子誘生水平的影響及意義

王志敏1，潘學(xué)霞2，李尊昌1，王雨存3，王立盼1

（1. 濱州市人民醫(yī)院血液內(nèi)科；2. 兒科；3. 風(fēng)濕免疫科，山東 濱州 256600）

目的探討抗CD137L單克隆抗體阻斷CD137/CD137L信號通路對再生障礙性貧血（aplastic anemia, AA）T淋巴細(xì)胞亞群及單個核細(xì)胞體外誘生細(xì)胞因子水平的影響，及其在AA免疫治療中的作用和意義。方法采用流式細(xì)胞術(shù)及ELISA方法，分析AA患者經(jīng)抗CD137L單抗刺激前后骨髓T淋巴細(xì)胞亞群及單個核細(xì)胞誘生細(xì)胞因子IL-2、IFN-γ、IL-10的變化。結(jié)果AA患者經(jīng)抗CD137L單抗誘導(dǎo)后骨髓CD3+、CD4+、CD8+、CD25+ T細(xì)胞比值顯著降低（P＜0.05），而對照組T細(xì)胞亞群幾無影響。抗CD137L使再障患者骨髓單個核細(xì)胞IL-2、IFN-γ水平降低，但較正常對照組升高（P＜0.05），使IL-10水平升高，但較正常對照組仍顯著降低（P＜0.05）。結(jié)論抗CD137L單抗可使AA患者T細(xì)胞亞群恢復(fù)或接近正常，使免疫狀態(tài)得到改善，亦可使體外骨髓單個核細(xì)胞（BMMNC）中IL-2、IFN-γ水平下降，IL-10水平提高，具有重要意義。

再生障礙性貧血；T淋巴細(xì)胞；抗CD137LmAb；細(xì)胞因子

再生障礙性貧血（aplastic anemia, AA）是一種骨髓造血功能衰竭性疾病，其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，目前的觀點(diǎn)認(rèn)為，細(xì)胞免疫異常介導(dǎo)的造血組織免疫損傷在AA的發(fā)病機(jī)制中起著重要作用。研究[1,2]已發(fā)現(xiàn)，在AA患者中T淋巴細(xì)胞活化異常，細(xì)胞因子分泌異常。T細(xì)胞的活化過程需要抗原信號和共刺激信號分子的雙重作用，如果共刺激信號被阻斷，則可誘導(dǎo)抗原特異性T細(xì)胞免疫。CD137/CD137L是除CD28/B7以外的另一對關(guān)鍵的共刺激信號因子，在T細(xì)胞的活化、增殖方面發(fā)揮重要作用[3]。抗CD137L單克隆抗體與活化T細(xì)胞表面的CD137L分子結(jié)合，阻斷CD137與CD137L的結(jié)合，從而阻斷CD137-CD137L信號通路，導(dǎo)致T細(xì)胞無反應(yīng)性并抑制免疫應(yīng)答[4]。然而，目前國內(nèi)關(guān)于體外阻斷CD137-CD137L通路是否能影響T細(xì)胞亞群和細(xì)胞因子分泌的報道很少，我們通過流式細(xì)胞術(shù)及ELISA方法，測定AA患者經(jīng)抗CD137L單抗作用前后T細(xì)胞亞群和骨髓單個核細(xì)胞在體外誘導(dǎo)的細(xì)胞因子變化可初步判斷阻斷共刺激信號對AA的糾正作用及對細(xì)胞免疫的可能作用。

1 對象和方法

1.1 對象 32例AA患者均為2011年4月-2014年11月我院血液科門診及初診住院患者，其中非重型AA（NSAA）22例，重型AA（SAA）10例，男性18例，女性14例，年齡12歲-49歲，中位年齡32歲，經(jīng)血常規(guī)、骨髓細(xì)胞學(xué)、骨髓活檢等檢查，診斷符合《血液病診斷和療效標(biāo)準(zhǔn)》。正常對照組16例，取自同期住院的非造血系統(tǒng)疾病患者，其中男性9例，女性7例，年齡14歲-52歲，中位年齡34歲。

1.2 主要儀器和試劑 流式細(xì)胞儀（美國becton-Dickinson公司）；37oC CO2培養(yǎng)箱：gbb-16型，上海heraeus公司；低速自動平衡離心機(jī)：ldz 5-2型，北京醫(yī)用離心機(jī)廠；臺式高速離心機(jī)：tgl-16g型，上海醫(yī)療分析儀器廠；淋巴細(xì)胞分層液（中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工程研究所）；抗CD137L單克隆抗體（深圳市景美有限公司）、CD3、CD4、CD8 flow單克隆抗體和絲裂霉素、植物血凝素（PHA）（Sigma）。IL-2、IL-4、IL-10、IFN-γ引物（上海生物工程有限公司）。

1.3 實(shí)驗方法

1.3.1 標(biāo)本采集 無菌條件下抽取AA患者骨髓8 mL-10 mL，抽取正常對照骨髓5 mL，肝素抗凝。

1.3.2 分離骨髓單個核細(xì)胞（BMMNCs） 密度-梯度法。

1.3.3 骨髓單個核細(xì)胞培養(yǎng) 把再障患者BMMNCs分為抗CD137L組、對照組在體外培養(yǎng)5 d后加入PHA（20 μg/mL），然后培養(yǎng)2 d。正常對照組骨髓單個核細(xì)胞體外培養(yǎng)5 d，加入PHA（20 μg/mL）2 d。收集培養(yǎng)的骨髓單個核細(xì)胞。離心取上清液，過濾，分裝，于-20oC冷凍。

1.3.4 ELISA方法檢測再障兩組及正常組細(xì)胞因子IL-2、IFN-γ、IL-10誘生水平。

1.3.5 免疫熒光標(biāo)記及流式細(xì)胞術(shù)分析 將BMMNC濃度約1×106個/mL，加入20 μL相應(yīng)熒光標(biāo)記單克隆抗體，混勻，室溫避光孵育30 min，然后離心去上清，懸浮細(xì)胞，4oC固定30 min，上機(jī)檢測。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 10.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析處理。計數(shù)資料采用率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗；計量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（Mean±SD）表示，組間比較采用t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 抗CD137L單抗對再障患者骨髓T淋巴細(xì)胞亞群分布的影響 再障患者BMMNCS加入抗CD137L單抗后，CD3+、CD4+、CD8+、CD25+細(xì)胞的比值較對照組顯著減低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05)，見表1。

2.2 抗CD137LmAb對骨髓MNC誘生細(xì)胞因子水平的影響 加入抗CD137LmAb組較未加組SAA、AA患者骨髓MNC誘生IL-2、IFN-γ水平顯著降低（P＜0.05），但顯著高于正常對照組（P＜0.05）。加入抗CD137LmAb組較未加組SAA、AA患者骨髓MNC誘生IL-10水平顯著增高（P＜0.05），但顯著低于正常對照組（P＜0.05）。數(shù)據(jù)見表2。

表1 抗CD137L單抗對再障患者骨髓T淋巴細(xì)胞表型的影響（Mean±SD, %）

表2 抗CD137L單抗對再障患者骨髓MNC誘生細(xì)胞因子水平的影響（Mean±SD, ng/mL）

3 討論

AA的發(fā)病機(jī)制較復(fù)雜，目前觀點(diǎn)認(rèn)為，造血干細(xì)胞、造血微環(huán)境異常、細(xì)胞免疫功能紊亂在AA的發(fā)病機(jī)制中起著重要作用。其中細(xì)胞免疫異常是再障患者免疫發(fā)病機(jī)制的主要方面。近年來，對AA細(xì)胞免疫異常的研究發(fā)現(xiàn)，包括T細(xì)胞亞群及相關(guān)細(xì)胞因子水平，提示T細(xì)胞異常活化及造血負(fù)調(diào)控因子的優(yōu)勢在AA發(fā)病機(jī)制中起重要作用。

CD4+ T細(xì)胞按其所產(chǎn)生細(xì)胞因子譜可分為Th1、Th2細(xì)胞，T細(xì)胞亞群的變化主要是TH1/TH2的異常，以及由此引起的細(xì)胞因子分泌異常。TH1細(xì)胞分泌IL-2、IFN-γ和TNF-α等細(xì)胞因子，TH2細(xì)胞分泌IL-4、IL-5、IL-6、IL-10和IL-13等細(xì)胞因子。IL-2可促進(jìn)T細(xì)胞增殖，增強(qiáng)T細(xì)胞、NK細(xì)胞的活性，除促進(jìn)IFN-γ的產(chǎn)生外，陳可冀等[5]研究證實(shí)，IL-2異常升高與AA患者細(xì)胞免疫功能紊亂有關(guān)。IFN-γ是T細(xì)胞分泌的一種負(fù)性造血調(diào)節(jié)因子，有研究[6]表明微量內(nèi)源性IFN-γ具有較強(qiáng)抑制作用。IL-10，又稱細(xì)胞因子產(chǎn)生抑制劑，具有明顯的免疫抑制和免疫調(diào)節(jié)作用，與AA患者細(xì)胞免疫紊亂的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)。T細(xì)胞的完全活化需要兩個信號：抗原識別信號和共刺激信號，共刺激信號缺乏會導(dǎo)致T細(xì)胞無能或免疫耐受[7,8]。AA其實(shí)質(zhì)是以骨髓造血組織為靶器官，細(xì)胞免疫異常介導(dǎo)的免疫性疾病，其共刺激信號系統(tǒng)的改變也逐漸受到關(guān)注。

1989年Kwon等從活化的鼠T細(xì)胞中分離出一種新的膜表面抗原，命名為4-1BB（CD137）[9]，此后的許多研究發(fā)現(xiàn)4-1BB屬于腫瘤壞死因子受體超家族，其配體屬于腫瘤壞死因子超家族，二者是除CD28/B7外的另一對重要的協(xié)同刺激信號，在T淋巴細(xì)胞的活化過程中起著重要作用。CD137主要通過協(xié)同CD3和CD28發(fā)揮共刺激作用。Pulle及Myers等研究認(rèn)為CD137共刺激途徑主要促進(jìn)CD8+ T細(xì)胞的增殖與分化，Myers等研究發(fā)現(xiàn)，CD137信號通路具有極化效應(yīng)，表現(xiàn)為I類細(xì)胞因子如IFN-γ的分泌增加，II類細(xì)胞因子如IL-10的分泌減少。

本研究證實(shí)，加入抗CD137L單抗后AA患者骨髓中CD3+、CD4+、CD8+、CD25+細(xì)胞比值較對照組明顯降低，表明抗CD137L單抗可使再障患者骨髓T淋巴細(xì)胞的增殖及活化受到抑制。用ELISA法測定經(jīng)抗CD137L單抗阻斷后骨髓MNC誘生細(xì)胞因子的水平，結(jié)果表明阻斷后IL-2、IFN-γ水平顯著下降，且SAA較NSAA中IL-2、IFN-γ有顯著增高，這與國內(nèi)外諸多研究結(jié)果相一致，IL-10誘生水平較正常對照顯著降低（P＜0.05），SAA患者與NSAA患者之間無統(tǒng)計學(xué)差異，說明AA患者存在明顯的細(xì)胞免疫及細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)的異常，這可能由于阻斷后T細(xì)胞的異常活化被抑制，原有的Th1/Th2平衡向Th1偏移現(xiàn)象被部分糾正，因此Th1型細(xì)胞因子IL-2、IFN-γ水平降低，Th2型細(xì)胞因子IL-10水平增高。

目前，免疫抑制是臨床上治療再障的主要方法，但此種治療手段并未使再障的治療有效率有顯著提高，所以探討其他的治療方法顯得十分必要。研究已表明AA有共刺激信號系統(tǒng)的異常，所以探索共刺激信號途徑的變化和干預(yù)有可能為AA的基礎(chǔ)和臨床研究提供新思路和開辟新途徑。

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Effect and significance of anti-CD137L monoclonal antibody on T cell subsets and cytokine induced level in aplastic anemia

Zhimin WANG1, Xuexia PAN2, Zunchang LI1,Yucun WANG3, Lipan WANG1
1. Department of Hematology; 2. Department of Pediatrics; 3. Department of Rheumatism Immunology;Binzhou People's Hospital, Binzhou 256600, China

ObjectiveTo investigate the effect of blocking CD137/CD137L signaling pathway on T lymphocyte subsets and cytokines induced by mononuclear cellsin vitro, and their roles in aplastic anemia (AA) immunotherapy.MethodsThe changes of bone marrow T lymphocyte subsets and mononuclear cells inducing cytokines (IL-2,IFN-γ, and IL-10) in AA patients before and after stimulation with anti-CD137L monoclonal antibody were analyzed by flow cytometry and ELISA.ResultsIn patients with AA, the ratio of CD3+, CD4+, CD8+ and CD25+ T cells decreased significantly after the induction of anti CD137L monoclonal antibody (P＜0.05), while the T cell subsets in control group almost had no effect. Anti-CD137L to patients with aplastic anemia bone marrow mononuclear cells of IL-2, IFN-γ levels decreased, but increased compared to normal control group (P＜0.05), which elevated IL-10 levels, but still significantly lower than the normal control group (P＜0.05).ConclusionAnti-CD137L monoclonal antibody can make T cell subsets of AA patients recover or near normal, improve the immune state, and also decrease the level of IL-2 and IFN-γ in bone marrow mononuclear cell (BMMNC), and improve IL-10 level.

Aplastic anemia; T cell; Anti-CD137LmAb; Cytokines