慢性阻塞性肺疾病對單個核細胞TLR 2/4信號通路的影響

吳玉英, 王曉華

(南京醫科大學附屬常州醫院 常州市第二人民醫院 呼吸科, 江蘇 常州, 213003)

慢性阻塞性肺疾病對單個核細胞TLR2/4信號通路的影響

吳玉英, 王曉華

(南京醫科大學附屬常州醫院 常州市第二人民醫院 呼吸科, 江蘇 常州, 213003)

目的觀察慢性阻塞性肺疾病(COPD)組患者外周血單個核細胞(PBMC) TLR2/TLR4、IRAK and NF-κB mRNA水平的變化。方法利用Ficoll分離法分離健康人及COPD組患者外周血單個核細胞，通過qPCR的方法檢測健康人及COPD患者的TLR2/TLR4、IRAK、NF-κB mRNA的表達水平。結果COPD組單核細胞TLR2、TLR4 mRNA水平較健康人未見明顯變化，但IRAK1/4以及NF-κB mRNA水平的變化相對健康對照組顯著下降(P<0.05)。結論TLR2/4信號通路的表達下調參與了COPD疾病進展。

慢性阻塞性肺疾病; Toll 樣受體2/4; IRAK; NF-κB

慢性阻塞性肺疾病(COPD)是一種以呼出氣流持續受限為主要病理生理特征、慢性氣道炎癥反應為主要病理改變的臨床常見病及多發病[1-2]。沈寧等[3]在研究細菌感染與免疫在COPD發病進程中的作用機制時發現，在細菌感染、香煙暴露等致病因素誘導下，Toll樣受體等模式識別受體被激活，啟動固有免疫，激活T淋巴細胞，發揮繼發性免疫學效應，參與肺組織的損傷與破壞。還有研究者[4]在對人體和小鼠實驗研究中證實，香煙煙霧的顆粒成分可以激活TLR4，可能是由TLR樣受體直接識別煙霧的顆粒成分，也可能是煙霧導致上皮細胞的損傷，進而被PRRs識別。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取5名健康志愿者，均為男性，平均年齡35歲; 5名COPD組患者，均為男性，平均年齡71歲，因急性加重住院治療，分組根據《慢性阻塞性肺疾病診治指南(2015版)》。

1.2 主要試劑

Trizol購自上海普飛; M-MLV、Rnase Inhibitor以及dNTPs購自promega; oligo dT購自上海生工; Bulge-Loop TM miRNA qPCR Primer Set購自廣州銳博; Primer(R&F) 由上海吉凱設計及合成; SYBR Master Mixture購自 TAKARA。

1.3 方法

1.3.1 外周血單個核細胞的提取: 抽取正常人及COPD患者外周血10 mL, 肝素抗凝，通過Ficoll Hypaque密度梯度離心法(2 000 r/min離心30 min)后吸取白膜層細胞, PBS洗滌2次(1 500 r/min離心10 min)，獲得單個核細胞。

1.3.2 TLR 2、TLR4、IRAK 1、IRAK 4、NF-KB mRNA表達檢測: ① RNA提取: 細胞收集入15 mL離心管中，隨后12 000 g、4℃離心10 min，棄上清; 加入1～2 mL Trizol混勻后靜置5 min, 隨后12 000 g 4 ℃離心5 min; 取上清液加入各干凈EP管，加入氯仿200 μL后充分振蕩混勻，隨后靜置5 min, 12 000 g、4 ℃離心15 min后取上清加入等比異丙醇，充分混勻; 隨后靜置10 min, 12 000 g 4℃離心10 min; 此時會出現RNA異丙醇沉淀，棄上清，加入DEPC水處理的75%乙醇1 mL; 隨后12 000 g 4 ℃離心5 min; 棄乙醇，空氣靜置2～5 min干燥沉淀，最后加入RNase-free H2O 10 μL溶解沉淀。② 逆轉錄反應: 反應體系: 5×Primerscript Mix Buffer 2 μL, RNA(根據測定的RNA的濃度決定使用的具體計量，每10 μL體系最多轉錄500 ng RNA), RNase free H2O, 共10 μL體系，反應條件為37 ℃ 15 min(逆轉錄), 85 ℃ 5 s(酶失活)。③ Real Time PCR反應: 引物設計: 內參基因GAPDH，上游引物序列TGACTTCAACAGCGACACCCA, 下游引物序列CACCCTGTTGCTGTAGCCAAA, 擴增片段大小121 bp; 目的基因IRAK1，上游引物序列TGAGGAACACGGTGTATGCTG, 下游引物序列GTTTGGGTGACGAAACCTGGA, 擴增片段大小119 bp; 目的基因TLR2, 上游引物序列CGGAAGATAATGAACACCAAGAC, 下游引物序列AGATCCCAACTAGACAAAGACTG, 擴增片段大小139 bp; 目的基因NFKB1, 上游引物序列AGGATTTCGTTTCCGTTATGT, 下游引物序列CCTGAGGGTAAGACTTCTTGTTC, 擴增片段大小92 bp; 目的基因IRAK4, 上游引物序列CCTGACTCCTCAAGTCCAGAA，下游引物序列ACAGAAATGGGTCGTTCATCAAA，擴增片段大小119 bp; 目的基因TLR4, 上游引物序列CCTGTCCCTGAACCCTATGA，下游引物序列CTTCTAAACCAGCCAGACCTT, 擴增片段大小137 bp。④ 反應體系: SYBR Green I Mix 10 μL, 引物上下游各0.4 μL, cDNA 1.2 μL, 加ddH2O至20 μL。反應條件: 95 ℃ 30 s, 95 ℃ 5 s、60 ℃ 25 s共40個循環; 融解曲線反應條件為: 95 ℃ 15 s, 60 ℃ 1 min, 95 ℃ 15 s。

1.4 數據分析

2-△△CT方法分析基因相對表達量(即表示實驗組目的基因的表達相對于對照組變化的倍數)。△CT=目的基因CT值-管家基因CT值, △△CT=實驗組的△CT值-對照組的△CT值(即△△CT=刺激后目的基因的△CT值-刺激前目的基因的△CT值)，相對量RQ=2-△△CT。凝膠電泳: 用含有5 μL 0.1%溴乙錠的3%瓊脂糖凝膠跑電泳分析PCR的終產物。DNA條帶用Tanon 3500凝膠電泳成像系統進行顯效。

2 結 果

2.1 COPD組患者TLR2和TLR4 mRNA的變化

作者收集COPD組患者和健康者外周血單個核細胞提取RNA后行實時熒光定量PCR檢測TLR2、TLR4 mRNA的表達變化，利用2-△△CT法進行數據分析，結果如圖1所示。COPD組TLR2 mRNA對比健康對照組的RQ值=1.214±0.184,P=0.282,n=5; COPD組TLR4 mRNA對比健康對照組的RQ值=0.913±0.172,P=0.626,n=5。2組在TLR2及TLR4 mRNA的表達水平無顯著差異。

2.2 COPD組患者IRAK1/4和NF-κB mRNA的 變化

作者收集COPD組患者和健康者外周血單個核細胞提取RNA后行實時熒光定量PCR檢測IRAK1、IRAK4以及NF-κB mRNA的表達變化，利用2-ΔΔCT法進行數據分析，結果如圖2所示。COPD組IRAK1/4以及NF-κB mRNA對比健康對照組的RQ值分別為(0.641±0.107)、(0.3 798±0.095)、(0.3 356±0.097) (P<0.05,n=5)。結果顯示, COPD患者的IRAK以及NF-κB的mRNA顯著減少。

圖1 COPD組及健康對照組TLR2、TLR4 mRNA水平的表達

3 討 論

研究[5]結果顯示, TLR參與了持續炎癥反應，但目前對TLR信號通路的研究還較為表淺，值得進一步深入基礎研究。TLRs是最主要的天然免疫識別受體，在肺部存在巨噬細胞、樹突狀細胞、肺上皮細胞及內皮細胞等，均表達TLR, 不同細胞主要表達的TLR不同。肺泡巨噬細胞表達TLR1、TLR2、TLR4、TLR6、TLR7及TLR8, 漿細胞樣樹突狀細胞表達TLR9及TLR7, 髓樣樹突狀細胞則表達TLR1～TLR4。通過激活細胞內信號的級聯反應導致炎癥介質的產生，啟動天然免疫應答[6]。目前的研究[7]多集中于TLR2及TLR4，尤其是TLR4。TLR2識別的PAMPs非常廣泛，包括病毒，細菌以及寄生蟲等。TLR4主要識別革蘭陰性菌脂多糖(LPS)、呼吸道合胞病毒等。有研究者[8]收集因肺鱗癌行肺葉切除的癌旁組織標本50例，根據肺功能分為COPD組和非COPD組，研究結果顯示 COPD組患者肺血管管壁及周圍大量炎細胞浸潤，細胞間質增多，管腔狹窄，平滑肌細胞增生肥大，出現明顯的肺血管重建，而且通過免疫組化法發現COPD組TLR4在肺動脈血管平滑肌細胞中的表達水平明顯高于非 COPD組，進一步支持TLR4信號通路參與了持續的炎癥反應。

還有研究者以AECOPD患者體內單核細胞衍生的肺泡巨噬細胞作為模型，結果顯示基礎狀態下AECOPD患者TLR4、NF-KB mRNA和蛋白表達及上清中TNF-α水平均顯著高于健康對照，表明AECOPD患者可能受到定植菌的長期刺激，巨噬細胞通過TLR4識別，使NF-KB處于活化狀態，炎癥因子TNF-α明顯增高，使氣道炎癥持續[9]。Tohn等[10]研究顯示COPD患者外周血單個核細胞表面TLR2、TLR4的表達水平與血清TNF-α、IL-6、IL-8的濃度成正相關。TLR-2主要在肺組織的肺泡巨噬細胞和肺泡Ⅱ型上皮細胞中表達，而不同的是, Kuroki等[11]研究發現長期受LPS刺激的單核細胞TLR-2表達下調，并且隨著LPS的刺激時間越長TLR-2表達下調越明顯。Droemanm[12]研究則發現COPD患者和健康吸煙者肺泡巨噬細胞表面TLR-2表達明顯降低，在受到LPS刺激時非吸煙者的肺泡巨噬細胞出現TLR-2表達呈下調趨勢。IRAK家族是TLRs/IL-1信號通路中的信號通路連接體和樞紐，基本上所有的TLRs信號通路都需要與它們連接，其中最重要的連接體是IRAK1和IRAK4。現有研究[13]表明IRAK1和IRAK4因具有激酶活性，在信號通路中起著正性調節的作用。

本研究結果顯示, COPD組患者TLR2及TLR4在mRNA水平的表達與健康人無顯著差異，但IRAK1/4及NF-κB mRNA水平的表達卻顯著下降，這與前提及的研究結果存在一定的差異。眾所周知，當機體受到病原體感染時，炎癥反應是人體進行抵抗的首要反應。炎癥反應可以激活先天性免疫和適應性免疫應答，并通過此種應答來解決問題和恢復體內的動態平衡。本研究結果顯示, COPD組患者TLR信號通路受到了抑制，那么必然影響炎癥反應的表達。另外，此部分患者均存在慢性缺氧，長期缺氧后可導致體內細胞能量代謝異常，進而影響了信號通路的傳導，甚至可出現細胞凋亡。

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Influenceofchronicobstructivepulmonarydiseaseontheexpressionoftoll-likereceptor2/4signalpathwayofperipheralbloodmononuclearcells

WUYuying,WANGXiaohua

(RespiratoryDepartment,TheSecondHospitalofChangzhou,ChangzhouAffiliatedHospitalofNanjingMedicalUniversity,Changzhou,Jiangsu, 213003)

ObjectiveTo investigate the expression changes of toll-like receptor 2/4 (TLR 2/4), IRAK and NF-κB mRNA on monocyte-derived dendritic cells of patients with chronic obstructive pulmonary disease.MethodsFicoll separation was been used to separate peripheral blood mononuclear cells of the healthy controls and patients with COPD. The expression levels of TLR2/TLR4, IRAK and NF-κB mRNA were detected for healthy controls and patients with COPD by the method of qPCR.ResultsThe expression of TLR2 and TLR4 mRNA in COPD group were similar to healthy people, but IRAK1/4 and the NF-κB mRNA expression levels were significantly lower than the healthy controls.ConclusionThe download expression of TLR2/4 signaling pathways play an important role in the progression of COPD.

chronic obstructive pulmonary disease; toll-like receptor 2/4; IRAK; NF-κB

R 441.8

A

1672-2353(2017)24-016-03

10.7619/jcmp.201724005

2017-07-22

王曉華, E-mail: xiaohuawang001@foxmail.com