莫西沙星在肺炎大鼠血液及肺組織的藥代動力學研究

李 奕，成 熙，曹玉書，徐世林，童皖寧，官振標，卓安山（.解放軍第4醫院呼吸科，上海 0008；.解放軍

第411醫院藥劑科，上海 200081）

社區獲得性肺炎（community-acquired pneumonia，CAP）是最常見的感染性疾病，有很高的發病率和死亡率。而肺炎鏈球菌（Streptococcus pneumoniae，S.p）是引起CAP最常見的致病菌[1]。2016年中國成人CAP診治指南推薦可選擇莫西沙星等呼吸喹諾酮類藥物作為初始經驗性抗感染藥物[2]。以往莫西沙星藥代動力學研究的數據通常來源于血漿或漿膜腔積液[3]中，而對于感染者局部組織的藥代動力學特點卻罕有報道。本課題組建立肺炎大鼠模型，莫西沙星灌胃給藥，應用微透析法同步采樣，觀察肺炎大鼠血漿及肺組織中的游離藥物濃度差異。

1 材料

1.1 實驗動物

周齡為4 ～ 6周的Wistar健康雄性大鼠12只，SPF級，體質量200 ～ 220 g[上海斯萊克實驗動物有限公司，實驗動物使用許可證編號：（滬）2007-0005，合格證號：2007000514232]。飼養環境：室溫19 ～ 26 ℃，相對濕度40% ～ 70%，光照周期為12 L : 12 D。實驗前禁食12 h過夜。

1.2 實驗菌株

肺炎鏈球菌由第二軍醫大學附屬長海醫院微生物實驗室提供，于接種前1 d接種于血瓊脂平板，置于37 ℃ CO2培養箱中培養24 h，用無菌生理鹽水稀釋成含細菌濃度為0.6×108cfu.mL-1的混懸液，備用。質控菌株為肺炎鏈球菌標準株（ATCC49619，上海寶米科生物科技有限公司提供）。

1.3 儀器與試藥

莫西沙星標準品（中國食品藥品檢定研究院，純度＞ 99%，批號1448606），莫西沙星片（拜耳醫藥保健有限公司，批號BJ13520），HPLC級甲醇（美國Burdick & Jackson公司），HPLC級乙腈（德國Merck公司）。CMA402型微量泵、CMA820型微量收集器、血管探針、肺探針（瑞典CMA公司）。ALC-V8S小動物呼吸機（上海奧爾科特生物科技有限公司）。安捷倫1100高效液相色譜儀配有Chemstation工作站（美國安捷倫公司）。

2 方法

2.1 莫西沙星含量測定

2.1.1 色譜條件 色譜柱：Agilent SB-C18柱（250 mm× 4.6 mm，5.0 μm）；流動相：乙腈-水（含0.1%甲酸，25 : 75）；流速：1.0 mL.min-1；分析時間：10 min；柱溫：30 ℃；進樣量：5 μL；檢測波長：295 nm。

2.1.2 標準品溶液的制備 精密稱取莫西沙星標準品粉末10.0 mg置10 mL量瓶中，加甲醇溶解，定容至刻度，得濃度為1.0 mg.mL-1的莫西沙星標準儲備液；取適當體積莫西沙星標準儲備溶液置于10 mL量瓶中，以甲醇逐級稀釋得濃度為25.00、10.00、5.00、2.50、1.00、0.50、0.25 μg.mL-1的莫西沙星標準溶液。

2.1.3 血漿樣品的處理 精密量取100 μL血漿樣品，置1.5 mL塑料離心管中，加入200 μL甲醇，漩渦混合30 s后，12 000 r.min-1離心10 min，取200 μL上清液于進樣瓶中，進樣量5 μL，進行HPLC-UV分析。

2.1.4 標準曲線與線性范圍 取空白血漿100 μL，精密加入莫西沙星標準對照品溶液20 μL，配成濃度分別為5.00、2.00、1.00、0.50、0.20、0.10、0.05 μg.mL-1標準含藥血漿，除不加200 μL甲醇外，其余按“2.1.3”項下方法操作，計算面積。以莫西沙星濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標。求得回歸方程為：Y= 13.801X+0.010 78（r= 0.999 9）。結果表明莫西沙星在0.05 ～5.00 μg.mL-1濃度范圍內線性關系良好。

2.1.5 定量限與檢測限 配制莫西沙星濃度為0.05μg.mL-1的標準含藥血漿5份，進行分析，依照當日標準曲線方程求得實測濃度為（0.050 1 ± 0.004 1）μg.mL-1，準確度90.8% ～ 112.7%。結果表明莫西沙星在血漿中的定量下限為0.05 μg.mL-1，S/N＞ 10，線性關系良好。經逐級稀釋，按S/N＞ 3測得莫西沙星在血漿中的檢測限為0.025 μg.mL-1。

2.1.6 精密度實驗 制備含莫西沙星濃度分別為0.05、0.50和5.00 μg.mL-1的標準含藥血漿（每個濃度做5 份），按“2.1.3”項下方法操作，連續測定3 d，計算日內和日間精密度。測得日內精密度RSD%分別為4.14%、2.56%、3.41%；日間精密度分別為4.00%、2.31%、4.36%，均小于10%，符合精密度要求。2.1.7 準確度實驗 以相對回收率表示，制備含有莫西沙星濃度分別為0.05、0.50、5.00 μg.mL-1的標準含藥血漿，按“2.1.3”項下方法操作，計算實測濃度與實際濃度的比值即為相對回收率。結果分別為106.10%、104.15%、107.39%，均在80% ～ 120%范圍內，且RSD% ＜ 10 %，符合要求。

2.1.8 穩定性考察 配制莫西沙星低、中、高3個濃度（0.05、0.50、5.00 μg.mL-1）各3份分別進行如下考察：①室溫放置3 h、24 h，4 ℃放置24 h；②– 40 ℃保存，反復凍融3次；③– 40 ℃保存30 d。測定樣品濃度，計算測得值與實際值的相對偏差（RE%）在– 9.32% ～ 4.80%，RSD均＜ 10%。結果表明樣品在上述條件下保持穩定。

2.2 肺炎大鼠模型

采用氣管穿刺法注入菌液建立肺炎大鼠模型。腹腔麻醉后，切開頸部皮膚暴露氣管，經氣管軟骨環間穿刺，注入肺炎鏈球菌混懸液0.2 mL（約0.12×108cfu/只），將大鼠直立位20 s，再使大鼠保持右側臥位10 min，促使菌液充分流入右肺。于接種后第5 ～ 7天建立大鼠右側肺炎模型。所有大鼠實驗結束后行病理解剖及肺組織勻漿培養證實建模成功。

2.3 探針植入

取造模成功的肺炎大鼠麻醉后，固定于保溫墊，在氣管上段做一T型切口，插入氣管導管，接小動物呼吸機輔助通氣，頻率75 ～ 80 次.min-1，潮氣量2.5 mL。于大鼠右側胸壁做斜行切口，止血鉗離斷第5肋骨前肋，充分暴露右肺。用注射器針尖稍刺破右肺中葉臟層胸膜，將肺探針向肺門方向鈍性植入肺組織，復位肺葉，固定探針并關閉胸腔。切開左側股靜脈，植入血管探針推送至下腔靜脈固定。

2.4 藥動學分析

莫西沙星模擬成人常用劑量400 mg.d-1，大鼠按體表面積折算給藥劑量為42 mg.kg-1[4]稀釋至1 mL溶液灌胃給藥，5 s內注入完畢，立即開始同步收集血漿及肺組織透析樣品。每10 min收集一次，60 min后每1 h收集一次，至第5小時結束。所有樣品通過HPLC分析。采用反向透析法測定探針回收率（Rdial），體內實際藥物濃度（Cu）由所得透析液濃度（Cm）按公式計算，Cu=Cm/Rdial轉化獲得。

采用DSA 3.0軟件（上海博佳醫藥科技有限公司）以非房室模型計算以下藥動學數據：曲線下面積（AUC）、平均駐留時間（MRT）、藥物消除半衰期（t1/2）、藥物在肺部的穿透率（PR =C肺/C血液）、藥物的分布系數（AUC肺/AUC血液）。

2.5 統計學方法

采用SPSS13.0統計軟件進行統計學處理，所有資料以表示。藥動學參數先經方差齊性分析，符合正態分布，采用兩樣本t檢驗，P＜ 0.05為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 藥-時曲線

灌胃給藥莫西沙星后，肺炎大鼠血漿及肺組織藥物濃度迅速上升，至1 h時達峰，隨后兩者同步下降。上升階段肺組織中莫西沙星的藥物濃度均高于血漿濃度。肺炎大鼠體內的血藥濃度-時間曲線見圖1。

3.2 肺組織穿透率（PR）

肺炎大鼠灌胃給藥后，莫西沙星在肺部的PR值最高1.87，最低0.89，平均為1.256±0.321。肺部穿透率-時間曲線見圖2。

圖1 莫西沙星在肺炎大鼠血漿及肺組織中的藥-時曲線Fig 1 Mean concentration-time curves of moxifloxacin in plasma and lung of pneumonia rats

圖2 莫西沙星在肺炎大鼠肺部穿透率-時間曲線Fig 2 Penetration rate-time curve of moxifloxacin in lung of pneumonia rats

3.3 主要藥動學參數

灌胃莫西沙星后，肺炎大鼠血漿及肺組織的Tmax、Cmax相近，但肺組織中t1/2及AUC0-∞明顯增高。藥物分布AUC肺/AUC血液為1.216 ± 0.041。MRT差異無統計學意義，P值為0.077，但從數值上看亦有延長趨勢。PK參數詳見表1。

表1 灌胃給藥莫西沙星在肺炎大鼠血漿及肺組織中的藥代動力學參數Tab 1 PK parameters in plasma and lung of pneumonia rats after gavage moxifloxacin

3.4 莫西沙星對肺炎鏈球菌的PK/PD參數

結合相關報道的MIC及MPC值，將本實驗結果Cmax和AUC0-∞與之相比，莫西沙星對肺炎鏈球菌的PK/PD參數見表2[a：趙春江等[5]報道莫西沙星對S.p的MIC90為0.125 mg.L-1；b：郭蓓寧等[6]報道莫西沙星對S.p的防突變濃度（mutant prevention concentration，MPC）為2 mg.L-1]。

4 討論

在引起CAP的細菌性病原體中，肺炎鏈球菌是最為常見的致病菌之一[7]。但是，其日益增長的耐藥性卻已經成了世界各國所關心的問題。革蘭陽性球菌的耐藥監測項目顯示，肺炎鏈球菌對口服青霉素的耐藥率從2005年的30%上升到了2010年的60%[8]。而全國細菌耐藥監測網發布2015年監測報告，肺炎鏈球菌對紅霉素耐藥率平均高達91.5%[9]。

表2 莫西沙星對肺炎鏈球菌的PK/PD參數Tab 2 PK/PD parameters of moxifloxacin for Streptococcus pneumoniae

氟喹諾酮類藥物具有抗菌力強、口服吸收好、與其他抗菌藥物無交叉耐藥及不良反應/事件較少等特點[10]。莫西沙星是新一代的8-甲氧基氟喹諾酮類藥物，抑菌機制為干擾拓撲異構酶Ⅱ和拓撲異構酶Ⅳ的活性，促使病原體的DNA雙鏈破壞，阻止DNA的復制和轉錄從而產生殺菌作用[11]。我國的多中心研究結果顯示，莫西沙星對肺炎鏈球菌的敏感度達99%，MIC90為 0.125 mg.L-1[5]。

莫西沙星說明書中介紹其在肺（肺泡液、肺泡巨噬細胞、支氣管組織）等組織中的濃度可超過血藥濃度。但這些數據都來源于正常受試者的結果，而感染者肺組織間液中的游離藥物濃度更為重要。我們采用微透析方法獲取肺炎大鼠肺組織間液中的游離藥物濃度，模擬反映莫西沙星在感染患者靶器官中的藥代動力學變化。

本研究結果表明，莫西沙星在肺炎大鼠肺組織中的藥-時曲線與血漿中趨勢基本一致，其在肺組織穿透率的范圍在0.89 ～ 1.87，平均為1.256±0.321，顯示出良好的組織穿透性。

從藥動學參數來看，雖然莫西沙星在肺炎大鼠血漿及肺組織中的Cmax相近，但在肺組織中的t1/2明顯延長，導致AUC0-∞有顯著性差異，AUC肺組織明顯高于AUC血漿，P值為0.003 2，肺內的分布系數達到了1.216±0.041。由于莫西沙星具備在肺組織分布濃度較高的特性，也使其成為了呼吸道感染的優選用藥。

隨著氟喹諾酮類藥物的廣泛使用，其耐藥率的上升趨勢已受到許多學者的關注。為此，將該藥的藥代動力學和藥效學結合才能更好的指導抗菌藥物的合理應用。為防止肺炎鏈球菌產生耐藥突變，Bowker等[12]建議氟喹諾酮類藥物應保持AUC/MIC（AUIC）比值大于100。通過實驗，我們發現在該劑量條件下，莫西沙星在肺炎大鼠血漿及肺組織AUIC均大于100，尤其是肺組織中達到了148.56，證明其在清除細菌的同時可以有效防止耐藥突變菌株的產生。這可能也是莫西沙星上市應用以來對肺炎鏈球菌始終保持高度敏感性的原因之一。

近年來提出的防耐藥突變濃度（MPC）和突變選擇窗（mutant selection window，MSW）概念，對控制感染的同時降低耐藥突變菌株的選擇性擴增具有重要的意義。有學者在研究莫西沙星對肺炎鏈球菌的體外藥效學模型后認為，AUC0-24/MPC及Cmax/MPC是與肺炎鏈球菌耐藥突變相關性更重要的PK/PD參數，當AUC0-24/MPC ＞ 13.41和Cmax/MPC ＞ 1.20時，肺炎鏈球菌可以達到完全根除，該值越高，就越可以有效地防止細菌耐藥性的出現[13]。郭蓓寧等[6]發現莫西沙星臨床常用劑量400 mg時血漿Cmax為4.3 mg.L-1，AUC為39.3 mg.h-1.L-1，計算所得AUC/MPC90及Cmax/MPC90分別為19.7和2.2，在該劑量條件下不僅可以清除細菌，且可以預防耐藥突變的產生。但其數據來源均為健康志愿者的全血藥物濃度。根據產品說明書，莫西沙星的蛋白結合率約45%，故測算其實際游離藥物的Cmax約為1.935 mg.L-1，AUC亦相應降低。而我們采用微透析法直接測定肺炎大鼠的的游離藥物濃度，血漿Cmax為4.83 mg.L-1，肺組織Cmax為4.84 mg.L-1，Cmax/MPC90分別為2.41及2.42，均＞ 1.20。

因此，在該劑量條件下，莫西沙星在肺炎鏈球菌感染的大鼠中，能夠有效清除細菌，獲得良好的療效，并且能防止耐藥菌株的突變富集。

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