閩南地區斜帶石斑魚(Epinephelus coioides)神經壞死病毒的基因型與分子進化研究

朱志煌，林克冰，周 宸，吳建紹，葛 輝，鄭樂云，黃種持

(福建省水產研究所，福建省海洋生物增養殖與高值化利用重點實驗室，福建 廈門 361013)

閩南地區斜帶石斑魚(Epinepheluscoioides)神經壞死病毒的基因型與分子進化研究

朱志煌，林克冰，周 宸，吳建紹，葛 輝，鄭樂云，黃種持

(福建省水產研究所，福建省海洋生物增養殖與高值化利用重點實驗室，福建 廈門 361013)

本研究以閩南地區具有典型神經壞死病癥狀的斜帶石斑魚為材料，采用RT-PCR法對其進行病毒檢測，對檢測到的陽性序列進行雙向測序和構建系統發育樹，對病毒顆粒進行分離純化，并通過分子進化模型分析病毒衣殼蛋白基因所受的選擇壓力。結果顯示，采集到的6個石斑魚樣品均呈NNV陽性，系統樹分析發現6個樣品的PCR擴增片段均為RGNNV基因型序列，表明閩南地區感染石斑魚的神經壞死病毒主要為RGNNV基因型病毒；通過PEG法對病毒進行分離提純，獲得直徑為25～28 nm、呈二十面立體對稱結構的無囊膜病毒顆粒；分子進化分析顯示NNV外殼蛋白基因經歷了純化選擇，表明病毒在進化過程中沒有出現遺傳變異并以相對恒定保守的速率進化。

斜帶石斑魚；基因型；神經壞死病毒；分子進化

石斑魚屬于鱸形目(Percifoemes)、魚旨科(Serranidae)、石斑魚屬(Epinephlus)魚類，其廣泛分布于熱帶和亞熱帶暖水海域。石斑魚是目前海水養殖魚類中的高檔優質魚類，其肉質鮮美并且富含多種人體必需的氨基酸和蛋白質，因而受到國內外市場的歡迎。在我國的海南、廣東、福建和浙江等省份，石斑魚已成為重要的海水養殖品種之一，養殖品種主要包括斜帶石斑魚、赤點石斑魚、云紋石斑魚和珍珠龍膽石斑魚等。近年來，由于石斑魚的養殖規模和密度的增加導致養殖環境變差，進而引起養殖品種爆發各種疾病，造成巨大的經濟損失[1-2]。

魚類病毒性神經壞死病(Viral nervous necrosis，VNN)是養殖石斑魚最常見且危害最大的傳染病。VNN的致病原是神經壞死病毒(Nervous necrosis virus，NNV)，感染病毒后的仔魚和幼魚會出現大量死亡，嚴重者在一周內死亡率可達100%[3]。由于極高的傳染性和危害性，VNN被世界動物衛生組織(Office International Des Epizooties，OIE)列為重要的魚類病害。福建南部主要的石斑魚養殖區(東山、漳浦和廈門)因該病毒的高感染率和高死亡率而損失慘重，這嚴重制約了閩南地區石斑魚養殖業的發展。至今市面上仍未有能夠有效治療神經壞死病毒病的方法。因此，分離純化高純度病毒、研究病毒結構特性和進化特點及研制高效的抗病毒藥物顯得尤為重要。本研究分析了閩南地區感染養殖石斑魚的神經壞死病毒的基因型，對病毒進行提純和分子進化研究，旨在為后期制備高效的病毒疫苗提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

實驗患病斜帶石斑魚(E.coioides)于2015年5—7月分別取自福建省廈門市和漳州市的6個不同養殖場。患病魚食欲減退，體色發白，未見組織壞死或糜爛，大多浮于水面，嘴巴張大，在水面打轉泳動，有的在水面上螺旋游動，有的在水面上沿直線方向快速游動，有的靜止腹部朝上，但被觸碰后立即開始游動，表現出明顯的癥狀(圖1)。將瀕死的病魚撈起，并迅速保存于-80°C低溫冰箱，備用。

1.2 實驗儀器與耗材

PCR儀；超速離心機；高速離心機；勻漿器；移液槍；剪刀；鑷子；離心管；0.9%生理鹽水；無水乙醇。

1.3 RNA提取、逆轉錄及PCR產物檢測

采用Invitrogen公司的Trizol試劑盒，按照說明書提取全魚樣本的總RNA。利用QuantScript RT Kit并按照說明書操作步驟來合成cDNA，提取的樣品保存在-20℃條件下，以備后續使用。病毒檢測方法按照《魚類病毒性神經壞死病(VNN)診斷技術規程》(SC/T 7216—2012)中RT-PCR方法，正向引物為：5’-CGTGTCAGTCATGTGTCGCT-3’，反向引物為：5’-CGAGTCAACACGGGTGAAGA-3’。PCR反應體系為50 μL，反應條件為：42℃ 30 min、95℃ 5 min，然后95℃ 40 s、55℃ 40 s、72℃ 40 s循環35次，最后72℃延伸5 min，4℃保存。反應PCR 產物用1%的瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，之后用凝膠成像系統查看電泳結果。用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒純化回收擴增產物，純化產物送往測序。每個產物重復測序3次以排除測序錯誤，并通過正反測序獲得產物全長。

1.4 序列比對和系統樹構建

從NCBI(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank/)和Ensembl(http：//www.ensemble.org/)等公共數據庫中，下載神經壞死病毒四種基因型(SJNNV、TPNNV、BFNNV和RGNNV)衣殼蛋白基因相關序列(表1)。通過Muscle軟件的codon模型對測序和下載的序列進行比對，并對序列進行手動修改以減少錯誤[4]。jModelTest軟件[5]被用來估算比對序列的最適核苷酸替代模型。按照jModelTest軟件選擇出的最優核苷酸替代模型，使用MrBayes和PhyML軟件分別構建貝葉斯系統發生樹和最大似然樹[6-7]。

表1 用于分子進化分析的病毒株及登錄號

1.5 分子進化分析

通過基于最大似然法(Maximum likelihood method，ML)的PAML軟件來計算基因所承受的選擇壓力[8]。PAML軟件包中Codeml程序中的位點模型(Site model)能夠檢測基因位點所受到的選擇壓力，通過M0和M3、M1a和M2a、M7和M8這三對嵌套模型(或稱巢式模型)來進行分析。最終通過似然比檢驗(Likelihood ratio test，LRT)，得到模型間兩倍對數似然值差異(2ΔL)，通過卡方分布(χ2)來檢驗自由度因模型參數不同存在的差異及零假設模型是否拒絕備擇假設模型，并判斷似然比檢驗是否具有統計學意義。只有通過了LRT檢驗，兩模型間卡方檢驗結果顯示有顯著差異存在，才接受備擇假設，認為存在正選擇位點。同時根據貝葉斯經驗貝葉斯法(Bayes empirical Bayes，BEB)來計算所對應ω值的位點的后驗概率值(Posterior probability，PP)。

1.6 NNV病毒提純、負染樣品制備和電鏡觀察

病毒提取步驟參照文喻玲等[9]的方法并進行改進。取病魚全魚，稱重。在無菌條件下將組織置于預先-80℃冷凍的研缽中研磨，使組織研磨成漿狀。以組織10倍比例加入滅菌的生理鹽水，制成組織懸液，用NaOH調pH至8.0，充分震蕩保證病毒顆粒游離。組織懸液在4℃條件下以5 000 g/min轉數，冷凍離心15 min，取上清液，獲得病毒粗提液。病毒粗提液按800 U/mL比例加入雙抗進行滅菌，4℃保存過夜。粗提液按10倍體積加入氯仿，劇烈震蕩后離心，去除脂質和雜蛋白。取離心完的上層清液，在冰浴條件下，一邊攪拌一邊加入固體NaCl和聚乙二醇-6000(PEG-6000)，使溶液的NaCl和PEG-6000的終濃度分別達到0.5 mol/L和10%，4℃靜置過夜，使用貝克曼J-25高速離心機經JA-25.50轉子12 000 g/min冷凍離心30 min，收集沉淀物。沉淀物加入生理鹽水充分吹打、溶解，5 000 g/min離心30min，收集上清液。上清液通過貝克曼Optima LE-80K超速離心機經SW40Ti轉子205 000 g/min離心3.5 h，收集病毒沉淀，將沉淀用適量的PBS溶液重懸，制成病毒懸液。取1滴病毒懸液滴在銅網上，濾紙干燥，加一滴磷鎢酸進行負染，濾紙吸干，電鏡觀察。

2 結果與分析

2.1 病毒PCR檢測結果

將采自不同養殖場的6個樣品進行NNV檢測，通過PCR擴增、凝膠電泳和EB染色，結果顯示6個樣品的NNV檢測結果均呈陽性(樣品標記為1-6)。NNV的瓊脂糖凝膠電泳結果見圖2。6個樣品在420 bp附近可擴增出特異性目的條帶，顯示NNV陽性，PCR產物片段大小與測序結果一致(圖3)。

2.2 系統進化發生樹結果分析

根據jModelTest軟件估算出的GTR+I+G最優替代模型，以羅氏沼蝦和凡納濱對蝦諾達病毒衣殼蛋白基因序列作為外群，并結合SJNNV、RGNNV、TPNNV和BFNNV 4個基因型序列和本研究所測序病毒序列來構建貝葉斯樹和最大似然樹(圖4)。最大似然樹顯示SJNNV和TPNNV基因型序列聚為一支(置信度為100)，而測序獲得的6條神經壞死病毒基因序列與RGNNV基因型序列聚在一起(置信度為100)，然后這三種基因型序列簇成一支(置信度為92)，再與BFNNV基因型序列合為一大支，并與外群序列分開(置信度為100)。貝葉斯樹顯示SJNNV和TPNNV基因型序列節點、測序序列與RGNNV基因型序列節點以及四種基因型序列樹形節點的后驗概率值(PP)分別為0.98、0.92和1.00。貝葉斯樹與最大似然樹的樹形結構相似，且都擁有較高的可信度，表明樹形結構可靠且檢測到的石斑魚NNV均為RGNNV基因型。

注：貝葉斯后驗概率和最大似然法自舉值被標注于主要的進化枝上。

Note：Bayesian posterior probabilities and maximum likelihood bootstrap values were labeled on the main clades.

2.3 神經壞死病毒衣殼蛋白基因的正選擇分析

為了研究神經壞死病毒衣殼蛋白基因的進化特點，PAML軟件被用來計算基因所承受的選擇壓力。M0-M3的LRT檢驗值為6.28，其P值為0.18，表示接受零假設M0模型，認為序列以單速率進化。M2a和M8模型分別檢測到1(2E)和2(2E，3T)個正選擇位點， M1a-M2a和M7-M8模型比對的LRT檢驗值分別是2.28和2.36，但它們的P值都大于0.01，表示接受零假設M1a和M7模型，表明病毒衣殼蛋白經歷了純化選擇(表2)。

表2 位點模型對NNV外殼蛋白基因的檢測結果

2.4 病毒電鏡檢測結果

電鏡觀察，病毒顆粒呈典型的二十面立體對稱結構，無囊膜，直徑為25～28 nm(圖4)。

3 討論

魚類病毒病的種類多、流行廣、癥狀復雜，且一種魚可能成為多種病毒感染的宿主，因此病毒是一種嚴重危害水產養殖業的病原。由于病毒寄生在寄主細胞內，因此病毒病是魚類疾病中最難治療的一類疾病，而且至今尚無理想的治療方法，主要還是以預防為主[10]。在國內已經報道的能引起養殖石斑魚患病的病毒主要是諾達病毒科和虹彩病毒科兩大類病毒[11]。福建作為石斑魚養殖大省，每年石斑魚育苗季節夏季和秋季經常大規模爆發神經壞死病毒病，導致大量魚苗死亡，給養殖戶帶來了巨大經濟損失。目前國內外學者已開展大量與石斑魚病害防治相關的研究，但對于VNN等危害嚴重的病害除了加強檢疫苗種、監測疫情和及時隔離病魚等方法外，至今尚無有效的防治措施。在針對海水魚病毒性疾病防治方面，最有效、最直接的方法是使用基因工程疫苗[12]。高效、低副作用的基因工程疫苗必須以解析和研究病毒分子結構為基礎，從而去尋找疫苗的主要有效成分和抗原分子，因此必須獲得高純度的病毒顆粒。

本研究通過采集閩南地區6個具有典型的病毒性神經壞死病癥狀的石斑魚樣品，經過病原檢測發現所有樣品均呈NNV陽性。系統發育樹顯示通過不同建樹方法能夠構建出相似的樹形結構，且檢測到的6條NNV外殼蛋白基因序列在系統進化樹上跟RGNNV聚為一支，為RGNNV基因型，表明福建閩南地區感染養殖石斑魚的神經壞死病毒類型主要為RGNNV基因型。通過PEG法對病毒進行提純，鏡檢發現病毒粒子為規則的大小為25～28 nm的二十面體無囊膜顆粒，結果與陳信忠[13]、彭智發[14]和黃劍南等[15]的研究結果相一致。病毒外殼蛋白是病毒顆粒的主要支架結構和抗原成分，負責接觸識別宿主，被認為有可能受到正選擇壓力作用，并與宿主經歷協同進化[16]。此外，有研究指出歐洲南部的神經壞死病毒衣殼蛋白基因上有幾個參與識別宿主的關鍵位點受到正選擇壓力作用[17]。分子進化分析顯示采集的6個閩南地區石斑魚NNV的外殼蛋白基因經歷了純化選擇，表明病毒以相對保守的速率進化且沒有出現遺傳變異。

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Thegenotypingandmolecularevolutionanalysisofnervousneurosisvirus(NNV)ininfectedEpinepheluscoioidesinsouthernFujian

ZHU Zhihuang，LIN Kebing，ZHOU Chen，WU Jianshao，GE Hui，ZHENG Leyun，HUANG Zhongchi

(Key Laboratory of Cultivation and High-value Utilization of Marine Organisms in Fujian Province，Fujian Fisheries Research Institute，Xiamen 361013，China)

In this study，we used the nervous neurosis virus(NNV)test standard of Office International Des Epizooties(OIE)to detect the viral nervous necrosis ofEpinepheluscoioidescollected from southern Fujian.All the six samples were detected to be infected with NNV.The positive clones were separately sequenced from both forward and reverse directions with vector primers，and the sequences were used to construct the phylogenetic trees.The virus particles were isolated and purified by PEG method.All the sequence information of positive clones was utilized to analyze the selection pressure of viral coat protein gene.The results showed that the collected six samples were infected with RGNNV，indicating that the infectious NNV of grouper was mainly RGNNV in southern Fujian.The virus was isolated and purified to obtain a kind of icosahedral virus particles with a diameter of 25～28 nm.Molecular evolution analysis showed that the NNV coat protein gene experienced the purification selection，indicating that the virus retained very low genetic variation.

Epinepheluscoioides；genotype；nervous neurosis virus；molecular evolution

2017-11-06

廈門南方海洋研究中心項目(14GZP75NF39)；福建省海洋高新產業發展專項(2014NO.21)；福建省海洋生物增養殖與高值化利用重點實驗室開放課題基金(2016fjscq05).

朱志煌(1988-)，男，碩士，實習研究員，研究方向：水產養殖生物病害防治技術.E-mail：zhu.zhi.huang@163.com

朱志煌，林克冰，周 宸，等.閩南地區斜帶石斑魚(Epinepheluscoioides)神經壞死病毒的基因型與分子進化研究[J].漁業研究，2017，39(6)：429-436.

S917.4

A

1006-5601(2017)06-0429-08