不同耐藥結(jié)核分枝桿菌蛋白LC-MS分析

郭熾星(通訊作者) 蔣敏慧 黎敬忠

（廣州市番禺區(qū)慢性病防治站檢驗(yàn)科 廣東 廣州 511400）

1.研究背景

WHO最新統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)表明，全球目前約有20億人感染結(jié)核分支桿菌，占全世界總?cè)丝诘慕?/3，其中活動(dòng)性肺結(jié)核患者達(dá)2000萬[1-3]。平均每年新發(fā)病例約600萬，絕大部分位于發(fā)展中國家。結(jié)核病的死亡率位于各類疾病之首，其廣泛流行對(duì)全球經(jīng)濟(jì)、社會(huì)發(fā)展及進(jìn)步構(gòu)成嚴(yán)重威脅[4]。我國是世界上22個(gè)結(jié)核病高負(fù)擔(dān)國之一，肺結(jié)核年新發(fā)患者和患病總?cè)藬?shù)僅次于印度，居世界第2位。目前，我國結(jié)核桿菌感染者約5億，活動(dòng)性結(jié)核患者約500萬，其中涂陽患者150萬。據(jù)統(tǒng)計(jì)顯示，有近60%的傳染性肺結(jié)核患者未被發(fā)現(xiàn)，使傳染源不能得到有效控制[5]。早發(fā)現(xiàn)、早診斷、選取敏感的抗結(jié)核藥物聯(lián)合治療是有效控制結(jié)核病蔓延的關(guān)鍵手段。

近年來，隨著生物、化學(xué)、軟件開發(fā)領(lǐng)域的交叉發(fā)展，數(shù)據(jù)庫的積累，越來越多的新型診斷方法開始走進(jìn)臨床診斷，尤其是蛋白標(biāo)志物的診斷，其中High Performance Liquid Chromatography Mass Spectrometry （HPLCMS）已經(jīng)成為一種逐漸被認(rèn)可的疾病標(biāo)志物篩查方法[6-7]。本文通過LC-MS的方法對(duì)近年來廣州地區(qū)結(jié)核分枝桿菌耐藥狀況以及耐藥結(jié)核分枝桿菌的蛋白指紋圖譜進(jìn)行分析，從而為制定本地區(qū)結(jié)核病預(yù)防、診斷、控制策略提供一定的理論依據(jù)。

2.實(shí)驗(yàn)部分

2.1 菌株來源

選取2016年8月-2017年3月在廣州市番禺區(qū)慢病防治站檢查疑似肺結(jié)核的住院患者100例。其中男性患者65例，女性患者35例，評(píng)價(jià)年齡為42.6歲。從100例患者痰液中分離出全部菌株，菌株進(jìn)行菌型鑒定和藥敏試驗(yàn)。菌型鑒定和藥敏試驗(yàn)：分枝桿菌培養(yǎng)、鑒定和耐藥性檢測(cè)按照《結(jié)核診斷實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)規(guī)程》進(jìn)行，藥敏試驗(yàn)采用比例法進(jìn)行確認(rèn)。

2.2 材料

緩沖液：50mM NH4HCO3（pH7.8）；碘乙酰胺溶液：55mM碘乙酰胺，50mM NH4HCO3；50%乙腈溶液：50mM NH4HCO3，50%乙腈；酶解液：12.5ug/mL胰酶，20mM NH4HCO3；色譜級(jí)乙腈，甲醇，異丙醇，甲酸購自CNW公司。DTT，IAM，NH4HCO3，Trypsin購自生工生物。實(shí)驗(yàn)用水為milipore超純水。酸性羅氏培養(yǎng)基及分枝桿菌藥敏羅氏培養(yǎng)管購買于珠海貝索有限公司。

2.3 樣本前處理

鑒定后得到30例臨床敏感株，阿米卡星、利福平單耐藥菌株各30例。7H9培養(yǎng)基培養(yǎng)50mL菌株（OD=0.8），7000rpm速率低溫離心10min，收菌。棄上清，菌體用10mL裂解液洗兩遍（50mM Tris（pH7.0），150mM NaCl和0.5mM PMSF），2mL裂解液重懸。Fastprep-24裂菌，離心收上清16000g低溫離心20min。收上清用，收上清用0.22μm濾膜過濾兩次，90份樣本低溫保存。

每份樣本加入200μL碘乙酰胺溶液，室溫避光30min，進(jìn)行蛋白烷基化；加入500μL加50%乙腈溶液，靜置5min，重復(fù)二次；加入純乙腈500μL，靜置5min，重復(fù)二次；將管中乙腈吸干，氮?dú)獯蹈桑患尤?00μL胰蛋白酶酶解液，4℃放置2h，37℃水浴過夜；6000rpm離心10min，吸取上清保存在4℃冰箱，待檢測(cè)。

2.4 LC-MS上機(jī)分析

色譜條件：色譜儀（Easy nLC 1200），色譜柱（C18 colum 3μm，75μm×15cm），流動(dòng)相（A：0.1% FA in H2O；B，0.1% FA in ACN）；分析流速為300nL/min；流動(dòng)相梯度：

表1 LC-MS測(cè)試流動(dòng)相梯度。

質(zhì)譜條件：

ESI源，掃描方式：ESI+模式，毛細(xì)管電壓：1.4kV和1.3kV，錐孔電壓：40V和23V，離子源溫度：120℃，脫溶劑氣溫度：350℃，錐孔氣流量：50L/h，脫溶劑氣流量：600L/h，碰撞能量（10～40V），離子能量：1V，每0.2s采集1次圖譜；準(zhǔn)確質(zhì)量測(cè)定采用蘆丁溶液為鎖定質(zhì)量溶液。質(zhì)量掃描范圍：50～ 1500m/z。

2.5 數(shù)據(jù)分析

采用儀器自帶MS數(shù)據(jù)處理軟件Thermo Proteome Discoverer（Thermo公司），完成樣本中成分提取及數(shù)據(jù)預(yù)處理，包括基線過濾、峰識(shí)別和積分，保留時(shí)間校正、峰對(duì)齊和質(zhì)譜碎片歸屬等分析。最后生成多肽信息，在蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行比對(duì)分析。

3.實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 菌群的分離培養(yǎng)

100 份患者痰標(biāo)本經(jīng)前處理后，接種于酸性羅氏培養(yǎng)基培養(yǎng)6周，挑選陽性菌群。阿米卡星、利福平單耐藥誘導(dǎo)耐藥結(jié)核桿菌各30例，誘導(dǎo)20代。臨床敏感株30例MTB1～30，阿米卡星單耐藥菌株30例AKM1～30，利福平單耐藥菌株30例RFP1～30。全部菌株通過高速離心、裂解進(jìn)行蛋白提取。

3.2 非標(biāo)記LC-MS蛋白鑒定

蛋白質(zhì)非標(biāo)記定量技術(shù)是通過液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)對(duì)蛋白質(zhì)酶解肽段進(jìn)行質(zhì)譜分析，無需使用昂貴的穩(wěn)定同位素標(biāo)簽做內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)，只需分析大規(guī)模鑒定蛋白質(zhì)時(shí)所產(chǎn)生的質(zhì)譜數(shù)據(jù)，比較不同樣品中相應(yīng)肽段的信號(hào)強(qiáng)度，從而對(duì)肽段對(duì)應(yīng)的蛋白質(zhì)進(jìn)行相對(duì)定量[8]。如圖1所示，非標(biāo)記定量方法的原理是以MS1為基礎(chǔ)，計(jì)算每個(gè)肽段信號(hào)在LCMS色譜上的積分，這個(gè)也是本報(bào)告所采用的Maxquant算法的原理。

圖1 Maxquant軟件進(jìn)行非標(biāo)記定量的原理

為了對(duì)全部測(cè)試樣本進(jìn)行定量測(cè)試，通過標(biāo)準(zhǔn)BCA蛋白的標(biāo)準(zhǔn)曲線，我們測(cè)出了三組樣本的蛋白濃度，并進(jìn)行濃度歸一化。以標(biāo)準(zhǔn)蛋白濃度為橫坐標(biāo)，OD595為縱坐標(biāo)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線圖，求出回歸方程，結(jié)果圖2所示。

圖2 蛋白BCA定量標(biāo)準(zhǔn)曲線。

中FASP方法[9]，酶解全部樣本蛋白，進(jìn)行LC-MS測(cè)試。如圖3所示，三組樣本的典型總離子一級(jí)圖譜。

圖3 三組樣本中典型原始色譜質(zhì)譜流出一級(jí)圖譜

3.3 耐藥結(jié)核菌株指紋蛋白圖譜的構(gòu)建

通過數(shù)據(jù)庫比對(duì)，我們?cè)谂R床敏感組得到2137種蛋白，阿米卡星單耐藥菌組得到2013種蛋白，利福平單耐藥菌組得到種蛋白1992種。為了判別組間是否具有差異，我們采用PCA建模方法對(duì)樣本進(jìn)行分析。如圖4所示，三組的PCA主成分分析顯示，三個(gè)組分的分組很好，組內(nèi)關(guān)聯(lián)性很高，組間查一下很大。其中，兩組耐藥組的關(guān)聯(lián)系比較強(qiáng)，但是相對(duì)于臨床敏感組主成分差異性很大。

圖4 三組樣本的PCA分析結(jié)果（A為AKM vs MTB；B為AKM vs RFP）

針對(duì)三個(gè)組分對(duì)應(yīng)的差異性物質(zhì)，通過PCA特征分析得到，通過數(shù)據(jù)庫比對(duì)我們將相關(guān)物質(zhì)進(jìn)行分析。為了進(jìn)一步驗(yàn)證不同組分之間的差異性物質(zhì)，我們對(duì)三個(gè)組份之間的物質(zhì)進(jìn)行了火山圖分析，兩兩對(duì)比，找到了兩類耐藥結(jié)核桿菌相關(guān)臨床敏感株的指紋蛋白類型。如表2所示，通過數(shù)據(jù)庫匹配分析我們發(fā)現(xiàn)，與臨床敏感組相比阿米卡星耐藥組有856種差異性蛋白被發(fā)現(xiàn)，其中顯著上調(diào)的有332種，明顯下調(diào)的524種；與臨床敏感組相比利福平耐藥組有726種差異蛋白，其中有441種明顯下調(diào)，285種明顯上調(diào)。阿米卡星耐藥組與利福平耐藥組相比有141種差異性蛋白被發(fā)現(xiàn)，其中下調(diào)67種，上調(diào)74種。

表2 阿米卡星、利福平單耐藥結(jié)核分枝桿菌相對(duì)于臨床敏感菌株差異性蛋白

其中主動(dòng)脈夾層外周血相對(duì)于臨床敏感組，阿米卡星、利福平單耐藥結(jié)核分枝桿菌差異性最大的蛋白分別是轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白。這一方法可以為不同耐藥結(jié)核分枝桿菌蛋白指紋圖譜提供一個(gè)新方法，也有助于進(jìn)一步揭示結(jié)核分枝桿菌的耐藥機(jī)制。

我問：“茫茫”是什么意思？“茫茫的大沙漠”是什么樣子的？（這個(gè)問題學(xué)生可以通過查詞典解決。）接著我出示幾張大沙漠的圖片讓孩子建立感性認(rèn)識(shí)，然后我又要求孩子用自己的話說說大沙漠的樣子。有的孩子說：“沙漠一望無邊，到處都是沙子。”有的孩子說：“在沙漠里，你看到的平地就是沙子地，山丘也是沙子山。”還有的孩子說：“翻過這座沙丘，前方等著你的還是沙丘，走了一天，兩天，三天……前方等你的還是沙子。”

4.討論

當(dāng)前結(jié)核分枝桿菌耐藥的機(jī)制普遍認(rèn)為是由染色體基因突變引起的，對(duì)于各種臨床藥物異煙肼、利福平、鏈霉素、吡嗪酰胺等抗結(jié)核藥物的耐藥菌株研究有大量報(bào)道[10-12]。大量研究發(fā)現(xiàn)，耐藥結(jié)核分枝桿菌的靶基因均有突變痕跡。然而，目前并非全部耐藥菌株都可以檢測(cè)到位點(diǎn)突變情況，所以結(jié)核分枝桿菌的耐藥機(jī)制有可能涉及到多組學(xué)的調(diào)控，尤其是蛋白水平的調(diào)控。

本文，通過與臨床敏感株進(jìn)行對(duì)比，得到了一系列阿米卡星、利福平單耐藥結(jié)核分枝桿菌差異性蛋白，這些差異性蛋白主要集中在轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白與延伸因子。臨床敏感組相比阿米卡星耐藥組有856種差異性蛋白被發(fā)現(xiàn)，利福平耐藥組有726種差異蛋白。并且，我們發(fā)現(xiàn)不同耐藥組分也存在大量差異性蛋白，阿米卡星耐藥組與利福平耐藥組相比有141種差異性蛋白被發(fā)現(xiàn)，這說明不同耐藥菌株的生長調(diào)控機(jī)制可能差異很大。我們發(fā)現(xiàn)了上百種差異性蛋白，這將為不同耐藥結(jié)核分枝桿菌蛋白指紋圖譜的建立提供一個(gè)新方法。

5.致謝

本文由廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目（粵科規(guī)財(cái)字[2015]110號(hào)）支持。

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