“腸胃清”對結(jié)腸癌皮下移植瘤奧沙利鉑治療的增敏作用及對腫瘤組織壞死凋亡的影響研究

余倩云 許建華 李朝衡 梁 芳 張瑞娟

（1.上海市黃浦區(qū)五里橋街道社區(qū)衛(wèi)生服務(wù)中心中醫(yī)科，上海200023；2.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬普陀醫(yī)院中醫(yī)腫瘤科，上海200062； 3.上海市普陀區(qū)人民醫(yī)院中醫(yī)科，上海200060）

結(jié)腸癌是一種高發(fā)的消化系統(tǒng)惡性腫瘤。2017年美國癌癥預(yù)測數(shù)據(jù)顯示結(jié)腸癌的發(fā)病率及死亡率在美國十大癌癥中均位居第三位[1]，2015年中國結(jié)腸癌位居全國癌癥發(fā)病及死亡的第五位[2]。治療結(jié)腸癌的主要方法之一是化療，而化療耐藥限制了化療療效，因此如何提高化療的敏感性是臨床急需解決的問題。近年來，中醫(yī)藥提高化療敏感性的研究日趨增多，也在臨床上得到廣泛應(yīng)用。腸胃清具有益氣健脾、解毒理氣之功效，長期臨床應(yīng)用于腸癌和胃癌的治療，能夠提高生活質(zhì)量，改善臨床癥狀及減少化療引起的毒副反應(yīng)[3]。本實驗室建立了皮下移植瘤模型，通過測量裸鼠皮下移植瘤的大小及計算抑制率，運(yùn)用蘇木精-伊紅染色法（HE）及DNA斷裂的原位末端標(biāo)記法（TUNEL染色法）檢測細(xì)胞壞死及凋亡程度，以觀察腸胃清提高L-OHP敏感性的作用及對腫瘤細(xì)胞壞死凋亡的影響，現(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1 實驗材料

1.1 實驗動物 SPF級BALB/C雄性裸小鼠購自上海西普爾-必凱實驗動物有限公司，生產(chǎn)許可證號：SCXK（滬）2008-0016，體重（20±2）g，飼養(yǎng)于上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬普陀醫(yī)院動物實驗室，動物實驗室許可證號：SYXK（滬）2008-0055，溫度18～20℃，適應(yīng)飼養(yǎng)1周后進(jìn)行實驗。

1.2 腸胃清 藥物組成：生黃芪30g，生白術(shù)15g，薏苡仁30g，黨參30g，豬苓24g，八月札24g，野葡萄藤30g，紅藤30g。由上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬普陀醫(yī)院制劑室熬煎，1mL含生藥2.66g。

1.3 細(xì)胞 實驗所用細(xì)胞為人結(jié)腸癌HCT-116細(xì)胞，從南京凱基生物公司購入。在37℃、5%CO2條件下，使用含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.4 試劑及儀器 RPMI Medium1640干粉及胎牛血清（Gibico公司）；硫酸鏈霉素（華北制藥公司）；奧沙利鉑（L-OHP，江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司）；苯甲基磺酰氟（上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司）；磷酸二氫鈉（上海新華化工廠）；0.22μm微孔濾膜（上海申安醫(yī)療器械廠）；電子游標(biāo)卡尺（廣陸數(shù)測）；DHG-907AH型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海華連醫(yī)療器械有限公司）；Cell240型CO2恒溫培養(yǎng)箱（德國賀利氏公司）；MDF-F71V型超低溫冰箱（Sanyo公司）；日本OLYMPUS光學(xué)顯微 鏡（OLYMPUSBX51）；德國Leica輪轉(zhuǎn)式病理切片機(jī)（RM2145）；電熱恒溫水浴鍋（上海醫(yī)療器械五廠）；眼科剪（上海器材廠）。

2 實驗方法

2.1 皮下移植瘤的建立 將處于對數(shù)生長期的結(jié)腸癌細(xì)胞HCT-116細(xì)胞消化后收集到離心管中，用PBS制成濃度為1×107/mL的細(xì)胞懸液，注意應(yīng)放在冰上操作。取4～6周齡BALB/c雄性裸鼠5只，體重大約（20±2）g，常規(guī)消毒裸鼠右前肢腋下，用1mL微量注射器及23號針頭吸取HCT-116單細(xì)胞懸液，以0.2mL/只接種，恒溫恒濕飼養(yǎng)。大約經(jīng)過15～20d，皮下腫瘤生長至直徑約1～1.5cm左右，選擇瘤生長旺盛且無破潰的裸鼠，作為供瘤鼠。脫頸處死，酒精消毒皮膚，用眼科剪剪開皮膚，小心剝離皮下腫瘤組織，將剝離的移植瘤塊用生理鹽水沖洗凈，去除壞死組織和纖維組織放置于4℃培養(yǎng)液中，剪碎成1mm3大小的組織塊。制作裸鼠皮下移植瘤模型：選裸鼠的右前肢腋下，酒精消毒皮膚，剪一個大約2mm的小口，用鑷子擴(kuò)張周圍，再將切好的瘤塊送入皮下，按壓大約30s后將裸鼠放至籠中如前飼養(yǎng)。

2.2 動物分組及藥物干預(yù) 當(dāng)裸鼠皮下移植瘤生長至150～300mm3左右時隨機(jī)分為模型組、L-OHP組、腸胃清組和腸胃清聯(lián)合L-OHP組（聯(lián)合組），每組10只。模型組腹腔注射生理鹽水（0.2mL/次，每周一、三、五各1次），灌胃生理鹽水（每周一、二、三、四、五各1次），連續(xù)3周；L-OHP組腹腔注射L-OHP（5mg/kg，每周一、三、五各1次），灌胃生理鹽水同模型組，連續(xù)3周；腸胃清組灌胃腸胃清（10g/kg，每周一、二、三、四、五各1次），腹腔注射生理鹽水同模型組，連續(xù)3周；聯(lián)合組灌胃腸胃清（方法同胃腸清組），腹腔注射L-OHP（方法同L-OHP組），連續(xù)3周。腸胃清體內(nèi)給藥根據(jù)人與小鼠等效劑量換算公式計算[5]。L-OHP劑量的確定：參照Mathieu等[5]建模方法來確定動物能夠耐受的且不引起動物死亡的最高劑量（Maximal tolerance dose，MTD），前期實驗確定L-OHP的MTD為10mg/kg，并以1/2MTD（5mg/kg）作為實驗劑量，與前期發(fā)表文獻(xiàn)一致[6-7]。

2.3 腫瘤體積的測量及抑瘤率的計算 腫瘤體積的變化反映藥物的療效。從給藥第1天即用電子游標(biāo)卡尺測量腫瘤最大直徑（A）、最短徑（B），每日測量1次，觀察4周，根據(jù)測量結(jié)果描繪腫瘤生長曲線，并在第29天計算抑瘤率。腫瘤體積以公式V=1/2AB2計算，抑瘤率%=[（模型組平均瘤體體積－給藥組平均瘤體體積）/模型組平均瘤體體積]×100%。

2.4 HE染色測定腫瘤壞死程度 4周后實驗結(jié)束處死裸鼠，迅速剝離瘤體，取腫瘤組織經(jīng)福爾馬林固定1周，病理科石蠟包埋，切片厚度大約4μm。切片放于70℃溫箱烘烤融蠟1～2h，常規(guī)二甲苯脫蠟，乙醇脫蠟，蘇木素染色10min，流水沖洗，去除余色，0.7%鹽酸乙醇分化數(shù)秒，自來水沖洗，切片變藍(lán)大約15min，95%乙醇30s，酒精性伊紅染色30s，常規(guī)脫水透明，中性樹膠封片，電鏡下觀察結(jié)果，并進(jìn)行圖像分析。選擇每個標(biāo)本最大斷面切片計算腫瘤壞死面積占瘤體面積的百分率，測定腫瘤壞死程度如下：輕度壞死（≤30%）；中度壞死（＞30%）；重度壞死（＞70%）。

2.5 TUNEL染色測定腫瘤細(xì)胞凋亡情況 流程根據(jù)merk試劑盒說明書操作。4μm厚度的瘤組織切片，常規(guī)二甲苯脫蠟，經(jīng)各級乙醇脫水后，蒸餾水沖洗2min，滴加20g/mL不含DNase的蛋白酶K，37℃作用20min，PBS洗滌3次。在樣品上加適量的TUNEL檢測液，37℃避光孵育60min。PBS洗滌3次，加入DAPI液進(jìn)行核染色3min，PBS洗滌3次，避光在熒光顯微鏡下觀察、讀片。鏡下觀察塊狀棕黃色為陽性表達(dá)，陰性對照無結(jié)果，陽性定位為細(xì)胞核。Tunel凋亡檢測：細(xì)胞核中有棕色顆粒，核固縮，為陽性細(xì)胞。細(xì)胞凋亡指數(shù)（AI）的計算，選取的片子細(xì)胞數(shù)大約要在500個以上，隨機(jī)選取100個左右細(xì)胞區(qū)域，選擇核固縮的為陽性凋亡細(xì)胞，以百分?jǐn)?shù)作為凋亡指數(shù)。

2.6 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。實驗數(shù)據(jù)采用（±s）表示，多樣本比較采用單因素方差分析，用Levene檢測方差齊。若方差齊，則各組之間兩兩比較采用LSD檢驗；若方差不齊，采用近似 F 檢驗Welch檢驗，各組間比較采用Dunnett方法。以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 實驗結(jié)果

3.1 各組裸鼠給藥前后腫瘤體積及抑瘤率比較 各組皮下移植瘤生長曲線表明，隨著時間延長，各組腫瘤體積逐漸增大，但各組增長幅度不同，以模型組增長幅度最大，而聯(lián)合組最小，見圖1。各組裸鼠給藥前后腫瘤體積和抑瘤率比較見表1。

圖1 各組裸鼠皮下移植瘤瘤體變化曲線

表1 各組裸鼠給藥前后瘤體體積以及抑瘤率比較（±s）

表1 各組裸鼠給藥前后瘤體體積以及抑瘤率比較（±s）

注： **與模型組比較，P＜0.01；##與L-OHP組比較，P＜0.01；△△與腸胃清組比較，P＜0.01。

組別 動物數(shù)（只）給藥前（mm3）給藥后（mm3）抑瘤率（%）模型組 10 284.73±18.22 1439.08±139.89腸胃清組 10 297.03±21.23 1335.31±92.44** 7.21 L-OHP 組 10 315.02±23.19 1130.28±103.59** 21.46聯(lián)合組 10 304.55±17.64 835.52±79.76**##△△ 41.94##△△

3.2 各組裸鼠皮下移植瘤組織病理學(xué)形態(tài)與壞死程度比較 電子顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)結(jié)腸癌HCT-116細(xì)胞裸鼠異位移植瘤體組織切片呈低分化腺癌。200倍顯微鏡下觀察各組腫瘤組織壞死程度，并統(tǒng)計壞死比例，結(jié)果見表2。400倍顯微鏡下顯示：模型組癌細(xì)胞呈現(xiàn)橢圓形、圓形或不規(guī)則形，細(xì)胞分化較差，胞漿豐富，細(xì)胞核深染，核仁胞漿比增大，分裂相增多，排列紊亂，間質(zhì)可見少許結(jié)締組織；腸胃清組癌細(xì)胞可見細(xì)胞核呈藍(lán)紫色，細(xì)胞漿呈現(xiàn)粉紅色，細(xì)胞整體排列較紊亂；L-OHP組癌細(xì)胞數(shù)目減少，細(xì)胞核質(zhì)比減小，核固縮多見，排列疏松，間質(zhì)結(jié)締組織增多，細(xì)胞散在分布，腫瘤壞死區(qū)呈片狀，組織間隙滲出；聯(lián)合組癌細(xì)胞組織間隙滲出明顯，細(xì)胞破裂壞死，細(xì)胞散在分布，排列疏松，并伴有大片狀壞死，大量的結(jié)締組織增生，可見大部分核固縮，細(xì)胞呈碎裂狀。見圖2。

表2 各組腫瘤組織壞死程度（等級）及百分比比較（±s）

表2 各組腫瘤組織壞死程度（等級）及百分比比較（±s）

注：**與模型組比較，P＜0.01；#與L-OHP組比較，P＜0.05；△△與腸胃清組比較，P＜0.01。

組別 動物數(shù)（只） 壞死組織百分比（%） 壞死程度等級模型組 10 23.17±2.24 輕度腸胃清組 10 31.48±3.01** 中度，偏向于輕度L-OHP組 10 66.46±4.63** 中度，偏向于重度聯(lián)合組 10 76.83±5.39**#△△ 重度

圖2 各組裸鼠腫瘤組織病理形態(tài)學(xué)比較（×400）

3.3 各組裸鼠皮下移植瘤組織細(xì)胞凋亡情況比較 見表3。腫瘤組織凋亡細(xì)胞呈現(xiàn)細(xì)胞核著棕黃色，核固縮，染色質(zhì)濃縮，實驗表明模型組凋亡細(xì)胞數(shù)量最少，而聯(lián)合組凋亡細(xì)胞數(shù)量最多，明顯高于L-OHP組和腸胃清組，見圖3。

表3 各組腫瘤細(xì)胞凋亡指數(shù)比較（±s） %

表3 各組腫瘤細(xì)胞凋亡指數(shù)比較（±s） %

注：**與模型組比較，P＜0.01；##與L-OHP組比較，P＜0.01 ；△△與腸胃清組比較，P＜0.01。

組別 動物數(shù)（只） 凋亡指數(shù)（AI）模型組 10 4.42±1.62腸胃清組 10 11.54±2.65**L-OHP 組 10 38.83±5.38**聯(lián)合組 10 59.35±7.95**##△△

圖3 Tunel染色各組裸鼠腫瘤細(xì)胞凋亡情況（×200）

4 討論

結(jié)腸癌是的發(fā)病率及死亡率呈逐年上升趨勢，嚴(yán)重危害著人類的健康。外科手術(shù)是治療結(jié)腸癌的主要方法，但部分晚期患者無手術(shù)指征，則首選化療，含有L-OHP的化療方案仍是治療結(jié)腸癌的重要手段。但是隨著L-OHP的運(yùn)用，患者對L-OHP的敏感性逐漸降低，因此提高腫瘤細(xì)胞對化療敏感性尤為重要。本病屬于中醫(yī)學(xué)“鎖肛痔”“癥瘕”“腸覃”“腸風(fēng)”“下利”“臟毒”等范疇[8]，其發(fā)生發(fā)展是由于正氣不足，機(jī)體陰陽失調(diào)，臟腑經(jīng)絡(luò)氣血功能失司，引起氣滯血瘀、痰凝濕聚等發(fā)于結(jié)腸，久而發(fā)展成癥瘕積聚。

腸胃清為上海名中醫(yī)范忠澤教授的經(jīng)驗方。范忠澤教授認(rèn)為結(jié)腸癌的發(fā)生是由于機(jī)體內(nèi)環(huán)境失調(diào)，同時邪濁瘀滯，即“內(nèi)虛邪實”，治療時應(yīng)以扶正祛邪相結(jié)合。脾胃是后天之本，氣血生化之源，主要以益氣健脾來達(dá)到扶正補(bǔ)虛。故腸胃清方中采用生黃芪、黨參益氣健脾，生白術(shù)、豬苓、薏苡仁健脾燥濕，八月札、野葡萄藤、紅藤理氣解毒。前期研究顯示臨床觀察組經(jīng)腸胃清口服液聯(lián)合化療治療后患者的生存質(zhì)量、化療引起的毒副反應(yīng)、臨床癥狀得到改善，生存期延長，且患者外周血中MDR1 mRNA和CK20 mRNA表達(dá)均低于對照組，提示其作用機(jī)制可能與逆轉(zhuǎn)腫瘤耐藥有關(guān)[3]。張瑞娟等[9]研究表明腸胃清聯(lián)合L-OHP能夠抑制裸鼠皮下移植瘤的生長，增加L-OHP的療效，其增效的機(jī)制可能與上調(diào)促細(xì)胞凋亡蛋白Caspase3的表達(dá)有關(guān)。余文燕等[10-12]研究發(fā)現(xiàn)腸胃清能有效地逆轉(zhuǎn)HCT-116/L-OHP耐藥株對奧沙利鉑、順鉑及卡鉑的耐藥，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，改變細(xì)胞周期的分布。前期研究結(jié)果提示，腸胃清不僅可以改善患者生存質(zhì)量，還能夠增加結(jié)腸癌對化療藥的敏感性，逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞對化療藥的耐藥現(xiàn)象。

本實驗通過建立裸鼠HCT-116細(xì)胞皮下移植瘤模型，經(jīng)分組干預(yù)觀察，腸胃清聯(lián)合L-OHP組對瘤體生長抑制最明顯，腫瘤組織壞死面積比例最大，程度最重，腫瘤細(xì)胞凋亡指數(shù)最高，與L-OHP組和腸胃清組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義，表明腸胃清可增強(qiáng)結(jié)腸癌細(xì)胞對L-OHP的敏感性從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞壞死及凋亡，其可能的作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

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