用全內反射瞬逝場照明磁鑷研究Bloom解旋G-四聯體?

趙振業 徐春華 李菁華黃星榞 馬建兵 陸穎

1)(中國科學院物理研究所,軟物質物理重點實驗室,北京 100190)

2)(中國科學院大學物理學院,北京 100190)

3)(廣東工業大學材料與能源學院,廣州 510006)

用全內反射瞬逝場照明磁鑷研究Bloom解旋G-四聯體?

趙振業1)2)徐春華1)2)李菁華3)黃星榞1)2)馬建兵1)2)陸穎1)2)?

1)(中國科學院物理研究所,軟物質物理重點實驗室,北京 100190)

2)(中國科學院大學物理學院,北京 100190)

3)(廣東工業大學材料與能源學院,廣州 510006)

Bloom解旋酶,G-四聯體,全內反射,磁鑷

1 引 言

G-四聯體(G-quadruplex,G4)是由富含串聯重復鳥嘌呤(G)的脫氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸折疊形成的特殊結構.它是由Hoogsteen鍵連接,其中還需要一價陽離子(Na+或K+)來維持其結構的穩定性,如圖1(a)所示.迄今為止認為在DNA中有多種G4結構[1],這些結構受一價陽離子、尾鏈的長度及序列和三條G4鏈的連接環(loop)所影響[2].端粒末端的G4是目前研究得較為透徹的一種G4結構.在鈉溶液(Na+)環境中G4只有一種反平行結構[3],而在鉀溶液(K+)環境中則有三種較復雜的結構(hybrid1,hybrid2,two layer parallel)[4].而進一步的研究認為在端粒末端的G-四聯體主要有兩種結構[5].文獻[6,7]報道了失去一條鏈的G4也可以穩定存在,被稱為G-triplex(G3).端粒的G4對染色體DNA的復制及穩定性起重要作用[8],存在于調控序列的G4結構對基因表達、免疫調節等也有著至關重要的作用[9,10].

RecQ解旋酶是一種廣泛存在于原核生物到真核生物的DNA解旋酶,在基因組穩定方面有著重要的作用[11]. 人的細胞內含五種RecQ家族的解旋酶,其中Bloom(BLM),Werner和Rothmund-Thomson綜合癥解旋酶的缺失會分別造成Bloom[12],Werner[13]和Rothmund-Thomson綜合癥[14]三種遺傳疾病.Bloom綜合癥是一種極為罕見的遺傳病,它包括一系列的退行性病變如發育不良、智力低下、免疫能力缺失、不育以及多種罕見的癌癥.患者的細胞中會出現染色體不穩定,包括染色體斷裂、缺失以及姐妹染色單體互換[15,16].在細胞中,BLM是一種重要的解旋酶,可以解旋多種DNA底物,包括B-DNA,holiday junction[17],D-loop[18]以及G-四聯體[19].這些結構與細胞內DNA的復制、轉錄、同源重組等一系列過程相關.

研究發現,BLM甚至可以在沒有三磷酸腺苷(ATP)的存在下打開G4[20?22],而BLM依賴ATP解旋G4的過程則是分步進行的[21,23].這些研究都是采用單分子熒光共振能量轉移(smFRET)技術進行的,該技術雖然有空間分辨率高的優勢,但是由于熒光分子易于淬滅,存在觀測時間較短的問題.本文采用高精度磁鑷技術[24]對這一問題做了進一步研究,分析了BLM在生理條件下解旋G4的過程.同時,本文也采用smFRET技術研究了BLM解旋G4的過程,并與采用磁鑷研究的結果做了比較,研究了加載力在BLM解旋G4過程中的影響.通過對高濃度ATP下BLM解旋G4的研究發現BLM可以在解旋G4后長時間停留在單鏈DNA,這為進一步研究BLM解旋G4的機理提供了新的思路.

2 實驗原理與方法

2.1 DNA的制備

實驗中所用的DNA序列如表1所列,所有的DNA單鏈都由上海生工合成及純化.用于修飾熒光球的DNA片段通過氨基羧基縮合的反應方式,在1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽/N-羥基琥珀酰亞胺(EDC/NHS)的催化下修飾于熒光微球(直徑200 nm,Invitrogen,F8811)的表面.磁鑷實驗中的G4底物由G4 DNA單鏈和雙鏈DNA手柄以1:1的比例混合并退火連接而成.

表1 實驗中用到的各寡聚核苷酸序列Table 1.Sequences of oligonucleotides for the experiment.

2.2 高精度磁鑷實驗

采用如圖1(b)所示的實驗系統,在G4序列前設計了18 nt長的單鏈,以保證BLM可以有效地與G4反應.實驗前先把聚乙二醇(PEG)修飾的蓋玻片和載玻片用雙面膠黏成密閉的小室,0.02 mg/mL鏈親和素溶于磷酸緩沖液(含20 mM磷酸鹽,pH 8.0,0.9%NaCl)沖入其中處理10 min.然后再用磷酸緩沖液沖洗,并用含10 mg/mL牛血清蛋白(BSA)的磷酸緩沖液封閉玻璃表面.先將已經修飾好的熒光球與G4底物按摩爾比1:10混合,避光室溫放置5 min,灌入小室,再孵育10 min.用磷酸緩沖液沖走游離的熒光微球和DNA底物.磁鑷所使用的Lambda DNA(NEB公司)手柄和磁球(Invitrogen,DynabeadsrM270 Amine,預先處理成抗地高辛修飾的表面)按1:10的摩爾比混合,室溫緩慢旋轉10 min,加入含10 mg/mL BSA的磷酸緩沖液稀釋至適當濃度,注入小室,孵育30 min,磷酸緩沖液沖去游離的磁球和Lambda DNA.當確定有單個的單分子連接后,便可加入BLM的反應緩沖液進行觀察.

實驗使用的高精度磁鑷裝置是對傳統的磁鑷裝置進行了改進,將磁力的測量和長度的測量分開.其中磁力的測量與傳統的縱向磁鑷的測量方式相同,通過計算磁球布朗運動而得出;而距離的測量則由全內反射場中的熒光球的光強變化計算得出[24].這一改進減少了布朗運動對磁鑷的空間分辨率的影響,而且可以更精確地測量出長度的相對變化.

圖1 (網刊彩色)(a)G4示意圖,M代表K或Na;(b)高精度磁鑷的單分子系統構成圖Fig.1.(color online)(a)Schematic illustration of the structure of G4,M represents K or Na;(b)scheme of the single molecule experiment system of high resolution magnetic tweezer.

2.3 smFRET實驗

smFRET實驗所用蓋玻片和載玻片都先用濃硫酸和過氧化氫溶液清洗,然后在蓋玻片表面固定99%甲基化聚乙二醇(Laysan Bio,Inc.)和1%的生物素化聚乙二醇(Laysan Bio,Inc.).鏈親和素(1 mg/mL)溶于包含有50 mM NaCl,20 mM Tris-HCl,pH 7.5緩沖液中,沖入實驗用的由PEG固定的蓋玻片制成的微流樣品池中,并孵育10 min.用上述緩沖液沖干凈后,在樣品池中加入20—50 pM濃度的DNA固定10 min.未固定于蓋玻片表面的DNA會被反應緩沖液沖走.然后在樣品池加入含抗淬滅劑(0.8%葡萄糖(D-glucose)、1 mg/mL葡萄糖氧化酶 (glucose oxidase)、0.4 mg/mL過氧化氫酶(catalase)和1 mM水溶性維生素E(Trolox))的反應緩沖液.實驗中所得的原始數據先進行三點平滑,FRET的效率由公式IA/(ID+IA)計算得出,其中ID代表供體的光強,IA代表受體的光強.

3 結果與討論

3.1 G4實驗反應條件的確定

單獨的G4去折疊實驗結果如圖2(a)所示,當將磁力緩慢加至G4去折疊態的位置時,可以看到G4在折疊和去折疊的狀態中來回跳躍.而在有時可以看見G4的中間態,如圖2(b)所示.圖2縱軸題l表示G4長度.這證實了所用的實驗設備可以觀察到G4的反應細節.在8 pN以下,我們從未看見G4的開合.根據之前的文獻[7,25]報道,G4去折疊最小需要7 pN的力,因此我們的實驗與之前的研究相符.這也確定了后面的實驗中所使用的力不超過7 pN,實際實驗過程中是將磁力加載在2—3 pN保持不變.

G4是一種依靠一價陽離子穩定的分子結構,一般認為鉀離子和鈉離子是穩定G4的主要穩定劑,而鉀離子穩定效果更佳.盡管也有實驗使用單獨的Na+作為穩定劑,但在我們的實驗中發現,單獨的Na+穩定效果很差.如圖3所示,在施加了2—3 pN的力以后,發現即使在150 mM NaCl溶液中,仍然可以看到G4不穩定的自發開合現象.而加載力相同的條件下150 mM KCl的溶液體系中,G4可以穩定存在.因此實驗中選擇用含150 mM KCl,50 mM NaCl,2 mM MgCl2和1 mM二硫蘇糖醇(DTT)溶于20 mM Tris-HCl,pH 7.5的緩沖液體系.在這種反應體系中,G4以鉀離子為穩定劑的構型存在[26].

圖2 (網刊彩色)(a)G4在臨界力下折疊-去折疊臨界轉變的反應曲線;(b)實驗中觀察到的G4折疊-去折疊的分步狀態Fig.2.(color online)(a)The magnetic tweezer(MT)trace of G4 folding-unfolding;(b)multiple steps in G4 folding-unfolding traces.

圖3 (網刊彩色)(a)150 mM KCl緩沖液中的G4磁鑷反應曲線;(b)150 mM NaCl緩沖液中的G4磁鑷反應曲線Fig.3.(color online)(a)The MT trace with 150 mM KCl;(b)the MT traces with 150 mM NaCl.

3.2 低濃度ATP下BLM分步解旋G4

在已報道的采用smFRET研究BLM與G4的相互作用實驗中,已確定BLM解開G4的過程是分步的.我們將磁鑷與全內反射熒光技術結合,得出了一致的結果.在10 nM BLM和1μM ATP的實驗體系中同樣觀察到了G4的分步解旋,如圖4(a).圖4(a)右側顯示的狀態為穩定的G3態,這一狀態中G4的一條鏈被打開成自由狀態,可以看到,底物在G4和G3兩個亞穩態之間來回振蕩.在可以穩定存在的實驗條件下,G4是不會自發打開至G3態的.這說明BLM在與G4結合后,會停留在G4上很長時間,從而造成了這種現象.為了保證這種現象是單個BLM造成的,我們繼續降低了BLM的濃度,在BLM的濃度為2 nM時可以看到反應終止于第100 s,如圖4(b)所示.在這一BLM濃度下,同樣可以看見底物在大部分時間處于G4和G3這兩個態之間.這意味著BLM在與G4結合后,可以停留在G4上較長的時間.這一結果表明BLM與G4有較長的反應時間,而且在這段時間內BLM并沒有離開過G4,說明BLM和G4有較長的結合時間.

當ATP濃度達到20μM時,實驗中已經基本無法看到中間過程,可以看到BLM在DNA上快速重復解旋.從DNA長度分布上來看,這一過程中的G3態已經不是很明顯.在本文實驗中,同樣可以觀察到這一過程可以持續很長的時間,如圖4(d)所示.

3.3 高濃度ATP下BLM解旋G4的兩種反應現象

上述的BLM與G4的反應研究中,為了觀察到反應的細節,大多都采用低濃度的ATP進行實驗.本文實驗中由于可以在較高的時間分辨率(50 Hz)下觀察較長的時間(300 s),我們進行了高濃度的ATP下BLM解旋G4的實驗.實驗中使用的ATP濃度為200—500μM,這一濃度已經接近于BLM與G4反應的飽和ATP濃度[18].為了保證可以觀察到單個BLM與G4的反應,實驗中使用的BLM濃度為2—5 nM.實驗中我們觀察到了兩種不同的反應現象.一種是高頻率的重復解旋現象,如圖5(a)所示.在實驗中,由于ATP的濃度已經接近飽和,這種高頻率的重復解旋發生的時間很長,同時這種現象還表現為G4在大部分時間處于打開的單鏈狀態.這一反應現象較為符合我們的預期.而另一種實驗現象則出乎我們的意料,觀察到了BLM在解開G4后,G4長時間處在單鏈狀態.這一過程甚至可以持續到50 s以上,如圖5(b)所示.這也意味著BLM在解旋G4后并沒有像它在解旋雙鏈DNA一樣繼續移動.已知的BLM解旋模型都認為ATP供能后BLM會在單鏈上移動,而我們卻發現了這一反常現象.上述兩種現象以及我們在低濃度ATP中的實驗結果都可得出一致的結論,即BLM在ATP參與下與G4的反應過程中都表現出與G4很高的親和力,這也與文獻[20,22]的報道一致.

圖4 (網刊彩色)低濃度ATP下磁鑷的反應結果 (a)10 nM BLM,1μM ATP下BLM解旋G4的曲線和伸長分布;(b)2 nM BLM,1μM ATP下BLM解旋G4的曲線和伸長分布;(c)2 nM BLM,20μM ATP下BLM解旋G4的曲線和伸長分布;(d)5 nM BLM,20μM ATP下BLM解旋G4的曲線Fig.4.(color online)(a)The MT trace and histograms the length distribution with 10 nM BLM and 1μM ATP;(b)the MT trace and histograms of the length distribution with 2 nM BLM,1μM ATP;(c)the MT trace and histograms of the length distribution with 2 nM BLM,20μM ATP;(d)the MT traces with 5 nM BLM,20μM ATP.

與現階段通用的smFRET實驗方法相比,高精度磁鑷可以在較高的空間分辨率的前提下,同時提高時間分辨率和延長觀測時間.但是,與sm-FRET最重要的不同是高精度磁鑷可以在實驗中對反應底物施加拉力.對解旋酶而言,DNA是否受力會對解旋的模式產生重大影響[27].盡管在實驗中只施加了2—3 pN的極小的拉力,但是我們認為有必要確認在高精度磁鑷中觀察到的結果是否是受到力的影響.我們以FRET實驗來與磁鑷實驗結果進行對比.通過這種實驗方法,可以有效地測量3—8 nm的變化[28].為了測量實驗中G4的變化,構建了圖6(a)所示的DNA.已知G4打開會有21 nt的DNA伸長,而理論計算得出的長度變化為6—8 nm,反映在熒光共振能量轉移的效率曲線上,這個變化大約是由0.8到0.2.在加入G4無法穩定形成的緩沖液后,可以看到G4自發的開合,如圖6(b)所示.

圖5 (網刊彩色)高濃度ATP下磁鑷的實驗結果 (a)3 nM BLM,500μM ATP下BLM解旋G4的曲線和伸長分布;(b)2 nM BLM,500μM ATP下BLM解旋G4的曲線和伸長分布Fig.5.(color online)(a)The MT trace and histograms of the length distribution with 3 nM BLM,500μM ATP;(b)the MT trace and histograms of the length distribution with 2 nM BLM,500μM ATP.

3.4 加載外力對BLM解旋G4的影響

smFRET實驗中BLM解旋G4的反應條件與磁鑷實驗一致.如圖6(c)所示,在1μM的ATP下,smFRET的結果與磁鑷的結果基本一致.在smFRET實驗中我們也觀察到了BLM分步解旋G4的過程,同時也觀察到了長時間的重復解旋.如圖6(d)所示,在ATP濃度達到20μM時,BLM解旋G4的過程明顯加快,重復解旋的次數也明顯增多.本文smFRET結果與前述的smFRET結果是一致的.以上的結果說明在磁鑷實驗中加載2—3 pN的拉力對BLM解旋并沒有造成顯著影響.

為了觀察高濃度ATP下的解旋信號,我們降低了smFRET實驗中的激發光強,這在一定程度上降低了smFRET的空間分辨率,但卻可以延長觀測時間.如圖6(e)和圖6(f)所示,在200μM ATP的實驗結果中,同樣觀察到了兩種不同的實驗現象.在長時間停留的實驗現象中,由于使用了低濃度的BLM,所以在實驗中G4處于折疊態時,我們認為BLM沒有工作.這兩種現象與磁鑷的結果相對應.高濃度ATP的smFRET實驗結果再次證明了2—3 pN的力對BLM解旋的影響不大.同時,在磁鑷中得到的反常的BLM長時間停留于單鏈的現象也顯然不是由于磁力造成的.這種現象的機制值得進一步研究.

圖6 (網刊彩色)(a)FRET實驗中G4示意圖,G4與磁鑷實驗中的G4結構相同,cy3(綠色)和cy5(紅色)分別標在G4鏈上和互補的單鏈上,G4的單鏈和互補鏈形成雙鏈的支架,生物素將DNA連接于有鏈親和素的玻片表面上;(b)在10 mM KCl,50 mM NaCl溶液環境中cy3和cy5的熒光光強的曲線(上層)和FRET曲線;(c)2 nM BLM,1μM ATP下cy3和cy5的熒光光強的曲線(上層)和FRET曲線;(d)2 nM BLM,20μM ATP下cy3和cy5的熒光光強的曲線(上層)和FRET曲線;(e),(f)2 nM BLM,200μM ATP下cy3和cy5的熒光光強的曲線(上層)和FRET曲線Fig.6.(color online)(a)Schematic diagram of cy3(green)-and cy5(red)-labeled DNA construct(G4)with G4 having three G-quartet planes,the G4 strand and the complementary stem strand are annealed to form a duplex stem,biotin is used to immobilize the DNA to a streptavidin-coated coverslip surface;(b)traces of fluorescence intensities of cy3 and cy5(upper panel)and FRET trace(lower panel)in 10 mM KCl and 50 mM NaCl bu ff er;(c)traces of fluorescence intensities of cy3 and cy5(upper panel)and FRET trace(lower panel)of G4 with 2 nM BLM and 1μM ATP;(d)traces of fluorescence intensities of cy3 and cy5(upper panel)and FRET trace(lower panel)of G4 with 2 nM BLM and 20μM ATP;(e),(f)traces of fluorescence intensities of cy3 and cy5(upper panel)and FRET trace(lower panel)of G4 with 2 nM BLM and 200μM ATP.

4 結 論

本文中使用高精度磁鑷方法研究了BLM解旋G4的過程.實驗中繼smFRET實驗之后同樣觀察到了BLM解旋G4的分步過程,同時在小力的環境下,磁鑷除了可以提高分辨率以外,還可以定性地得出反應過程中能量的變化,其可長時間觀測的性能也使我們可以完成接近飽和ATP濃度體系的實驗.在這種實驗條件下觀察到了兩種反應現象:一種為重復解旋,另一種為反常的解旋后解旋酶停留.可從磁鑷實驗結果得出如下結論:BLM與G4在解旋過程中有很強的親和力.最后我們將使用smFRET實驗技術的結果與磁鑷實驗的結果進行對比,確定了外力在BLM解旋過程中的作用.本文的結果展示了高精度磁鑷的應用前景,它將來可以在單分子研究領域發揮更多的作用.

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Study of Bloom resolving G-quadruplex process by using high resolution magnetic tweezer with illumination of total internal reflection?

Zhao Zhen-Ye1)2)Xu Chun-Hua1)2)Li Jing-Hua3)Huang Xing-Yuan1)2)Ma Jian-Bing1)2)Lu Ying1)2)?

1)(Key Laboratory of Soft Matter Physics,Institute of Physics,Chinese Academy of Sciences,Beijing 100190,China)
2)(School of Physical Sciences,University of Chinese Academy of Sciences,Beijing 100190,China)
3)(Material and Energy School,Guangdong University of Technology,Guangdong 510006,China)

11 April 2017;revised manuscript

18 May 2017)

G-quadruplex(G4)is a DNA structure which commonly exists in human genome,and it is considered as an important structure in DNA metabolism such as replication,transcription and homologous recombination.The G-quadruplex helicases have been widely investigated these years.Of them,the Bloom(BLM)helicase is most thoroughly studied.However,there are some basic problems that are still unclear.Most of previous studies of G4 are performed by single molecule fluorescence resonance energy transfer technique.The G4 is in a free state in these experiments,which is different from the physiological environment in cells.The traditional magnetic tweezers have a limitation of spatial resolution in a low force circumstance.Thus here we use high resolution magnetic tweezer under the illumination of total internal reflection fluorescence to study the process of BLM resolving G4.Our modification of magnetic tweezer is to separate the measurements of force and distance of magnetic tweezer in order to improve the spatial resolution,which allows us to observe the unfolding process of G4.With a 2–3 pN force we find that the process of BLM unfolding G4 in low ATP concentration is stepwise,and the G4 is mainly in the state between G-quadruplex and G-triplex.We also find that the BLM could interact with G4 for a long time.Our apparatus is also able to obtain the long time observation results compared with the single molecule fluorescence technique.So we perform experiments with a nearly saturated ATP concentration.We find that the BLM has two ways to maintain G4 dissolution in this condition.The BLM could unfold the G4 repetitively in a long period and it could also keep the G4 in unfolding state for a long time after it has opened the G4.Finally,we also perform single molecule fluorescence resonance energy transfer experiment in the same condition,and we find that the 2–3 pN force in magnetic tweezers has a rare in fluence on the process of BLM interacting with G4.The results of single molecule fluorescence resonance energy transfer experiments are corresponding to the results of magnetic tweezer in the same conditions.All of our experimental results show that ATP dependent BLM has a high affinity with G4 and BLM has a different way to resolve G4 in high ATP concentration.These results could provide new ideas of the mechanism of BLM resolving G4.Our modi fied magnetic tweezer shows its capacity in G4 single molecule study,and it could be a useful tool in the future single molecule studies.

Bloom helicase,G-quadruplex,total internal reflection,magnetic tweezer

PACS:87.14.G–,87.15.H–,87.15.kjDOI:10.7498/aps.66.188701

*Project supported by the National Science Foundation of China(Grant Nos.11674382,11574381).

?Corresponding author.E-mail:yinglu@iphy.ac.cn

(2017年4月11日收到;2017年5月18日收到修改稿)

G-四聯體(G-quadruplex,G4)是廣泛存在于細胞基因組中的一種DNA結構,在DNA的代謝如復制、轉錄、同源重組等過程中起重要作用.G4解旋酶近年來受到廣泛研究,其中Bloom(BLM)解旋酶的研究已經相當豐富,但仍有一些基本問題不清楚.我們應用全內反射瞬逝場照明磁鑷對BLM解旋G4的動力學過程進行了深入研究,觀察到了BLM解旋G4的分步過程.相對于單分子熒光共振能量轉移技術而言,借助磁鑷的長時間觀測性能,我們在近飽和三磷酸腺苷(ATP)濃度的實驗體系中觀察到BLM長時間反復解開G4或者長時間維持G4于打開狀態的兩種作用方式.最后,使用相同的實驗條件做了單分子熒光共振能量轉移實驗,確定了加載2—3 pN的外力對BLM解旋G4沒有顯著影響.

10.7498/aps.66.188701

?國家自然科學基金(批準號:11674382,11574381)資助的課題.

?通信作者.E-mail:yinglu@iphy.ac.cn