中、重度少弱精子癥患者凍融精子與新鮮射出精子的ICSI臨床結局比較

劉項，張杜平，張洲*，孫建華，季興哲，楊杰，石絨，宋娟，孫崢，任鵬飛，王磊，高明，周梁

(1.西北婦女兒童醫院生殖中心，西安 710003；2.兵器工業521醫院，西安 710065)

男性因素導致的不育越來越受到人們的重視，單獨男方因素及合并男方因素引起的夫婦不孕不育約占50%。卵胞漿內單精子注射(ICSI)技術在治療重度男性不育方面具有非常重要的意義[1]，ICSI技術極大程度的降低了對精子的密度、活力、畸形率、精子穿透能力的要求[2]，甚至對于那些通過顯微取精技術自睪丸獲得的精子也有機會通過ICSI助孕獲得血親子代。然而對于中、重度少弱精患者，精子質量會有變差的可能，部分患者甚至在妻子取卵日不能順利取到可用做ICSI助孕的精子，因此對于這些患者，于試管助孕前行精子冷凍保存是保證助孕過程順利進行的一個不錯的選擇。但冷凍精子是否影響試管助孕結局，目前尚未形成統一意見[3-6]。有些學者認為凍融精子與新鮮射出精子對ICSI結局無明顯影響，而有人持相反意見：認為精子在冷凍過程中會對精子造成一定的損傷，并且冷凍精子的復蘇率及回收率也會降低，復蘇后精子活動力降低、DNA斷裂，從而影響ICSI的治療。目前，國內外對睪丸及附睪精子的新鮮及凍融精子的妊娠結局研究較多，但對新鮮射出精子與凍融射出的精子行ICSI妊娠結局研究較少，而對不同程度的新鮮射出精子和凍融精子的ICSI妊娠結局研究更少。本研究對在我中心接受ICSI治療的240個周期進行回顧性分析，旨在探討新鮮射出的中、重度少弱精子和凍融的中、重度少弱精子對ICSI結局的影響

對象與方法

一、研究對象

回顧性分析2014年3月至2015年5月在西北婦女兒童醫院生殖中心接受ICSI治療的240個周期。納入周期的患者皆因男方精子質量較差而于我院精子庫行精子冷凍保存，共有227人。納入標準：(1)男方至少經3次精液分析檢查，因上述原因于我院行精子冷凍保存成功的中、重度少弱精子癥患者；(2)近3個月內的精液檢查無支原體、衣原體、淋球菌等異常；(3)夫婦雙方染色體均正常；(4)女方無子宮畸形及卵巢低反應(取卵日獲卵數<4枚)，年齡<35歲，非多囊卵巢綜合征；(5)無遺傳性及家族性病史。

所有患者均簽署知情同意書。

二、方法

1. 分組：根據ICSI的精子來源，分為新鮮射出重度少弱精子組(A組)：107例111個周期，于妻子采卵日先試行留取新鮮精子，濃度<5×106/ml，且PR級<10%；新鮮射出中度少弱精子組(B組)：71名患者76個周期，濃度5～10×106/ml，且10%≤PR級<20%；凍融中、重度少弱精子組(C組)：49名患者53個周期，新鮮射出精液未找見活精子，采用事前于我院精子庫凍存的精子，解凍凍存精子，倒置顯微鏡下觀察/尋找活動精子，行ICSI。

2. 精子制備：(1)新鮮精液：取卵當天，男方禁欲3～7 d內手淫獲得精液，選擇密度梯度離心法或上游法收集活動精子；(2)凍融精子：將凍存的精子在取卵當日解凍，解凍過程如下：自液氮中取出精子冷凍管，將其投入37℃水浴中10 min，融解后倒置顯微鏡下觀察，若有活動精子，則用精子分離液(Spermrinse，Quins，美國)常規洗滌精子2遍，2次離心后再次加入Spermrinse液，轉移入培養皿行ICSI；若未找見活精子，則考慮行睪丸穿刺，但不歸入凍融組。

3. 受精、卵裂觀察、胚胎移植和ICSI結局判斷：顯微注射后16～18 h觀察受精情況，鏡下見2原核為正常受精。受精后24 h開始觀察卵裂情況，根據卵裂球的數目、大小、形狀、均勻程度、有無碎片等對胚胎進行分級(表1)。2原核(2PN)I級和II級胚胎為優質胚胎。移植后12 d測血HCG，陽性者診斷為妊娠。胚胎移植后28～35 d B超顯示孕囊或原始心管波動者診斷為臨床妊娠，妊娠終止發生在12周前診斷為早期流產。

表1 移植胚胎分級標準

三、統計學分析

結 果

一、一般資料比較

共納入240個ICSI周期，3組患者男、女雙方年齡和不育年限、HCG日E2水平、子宮內膜厚度、可用胚胎數情況見表2，HCG日E2水平、子宮內膜厚度均無統計學差異(P>0.05)(表2)。

二、臨床結局比較

3組間ICSI治療的臨床結局比較：A組、B組與C組相比，可用胚胎率、優質胚胎率的差異均有統計學意義(P<0.01)；3組患者在可用胚胎率、優質胚胎率、受精率、正常受精率、卵裂率、臨床妊娠率、種植率方面均無統計學差異(P>0.05)；A組、B組在可用胚胎率、優質胚胎率、受精率、正常受精率、卵裂率、臨床妊娠率、種植率方面均無統計學差異(P>0.05)(表3)。

表2 一般情況比較(-±s)

表3 ICSI治療臨床結局比較(%)

注：與C組比較，**P<0.01

討 論

一、精子冷凍保存對試管助孕的意義

ICSI技術是直接將精子注射入卵細胞內，使得精、卵結合，形成受精卵，成為治療中、重度少弱精子癥導致的男性不育的重要手段。但對于重度少弱精子癥、隱匿精子癥、逆行射精癥患者，若新鮮射出精子未找見活精子，多數患者需改行有創的睪丸或附睪穿刺取精手術，這類手術會破壞血睪屏障，并可能導致機體發生自身免疫反應。國內外學者[7-8]對睪丸穿刺后患者的機體免疫檢測發現：血睪屏障的破壞使得睪丸中的精子抗原突破血睪屏障進入血液，會產生抗精子抗體(AsAb)，AsAb多結合于精子尾部(68.9%)，影響精子的運動及受精。另外附睪的反復穿刺會造成附睪尾部阻滯機化，導致附睪管進一步梗阻，為再次穿刺帶來風險。因此，為順利完成試管助孕周期，避免反復手術操作對患者造成的創傷，提前冷凍保存精子是非常重要的。

目前，國內外已廣泛使用凍融的睪丸附睪精子行ICSI助孕，其妊娠結局及對子代的安全性無顯著差異[9-11]。甚至有研究認為，凍融技術的篩選能淘汰一些質量較差的胚胎和卵母細胞[12]。因此，在試管助孕治療中，對于重度少弱精子癥患者進周期前行精子冷凍保存是一個經濟、方便、安全而且有效的措施。

二、中、重度少弱精子癥患者新鮮射出精子與凍融精子的ICSI結局

國內外關于睪丸精子、附睪精子及凍融睪丸、附睪精子對ICSI結局影響的研究較多，但爭議較大[11，13-17]。對正常精液和輕、重度弱精子癥患者射出的新鮮精子ICSI結局的研究發現，輕度弱精子癥患者ICSI后的受精率和卵裂率與正常射出精子者無顯著差異，優質胚胎率低于正常射出精子者。重度弱精子癥患者的受精率、卵裂率和優質胚胎率均低于正常射出精子者。囊胚形成率在正常射出精子者、輕度弱精子癥和重度弱精子癥者依次下降，可能與重度少弱精子癥的精液中活性氧水平增加引起氧化應激有關，氧化應激誘導的精子損傷不僅影響精子的受精能力，還影響受精后胚胎的發育能力[6]。本研究中，中、重度少弱精子癥患者凍融精子組的可用胚胎率、優質胚胎率均顯著低于新鮮射出精子組(P<0.05)，而中度和重度少弱精子癥患者間新鮮射出精子的用胚胎率、優質胚胎率均無統計學差異(P>0.05)。本中心自2003年開展ICSI助孕技術，而本研究中所選樣本為2014～2015年期間，該時間段技術比較成熟，技術水平比較穩定。因此本研究認為凍融組可用胚胎率、優質胚胎率劣于新鮮組的結論不受實驗室技術水平的差異干擾。Park等[18]的研究也發現凍融精子與新鮮精子的優質胚胎率存在顯著差異，但它們之間臨床妊娠率無顯著差異。其原因可能與精子在冷凍復蘇過程中產生大量的活性氧有關，氧化應激對精子中段、尾部的膜內板損傷最大，進而導致DAN損傷[19-22]。精子DNA損傷可能會影響胚胎的質量。本研究發現凍融精子與新鮮精子ICSI治療的正常受精率、卵裂率、種植率和臨床妊娠率均無統計學差異。因此對于女方條件比較好，預計獲卵數較高的中、重度少弱精子癥患者，在試管助孕前可考慮行精子冷凍保存[23]，精子冷凍保存不僅可以避免睪丸穿刺對睪丸、附睪的損傷，也可以使得對生育力持續下降的患者保留了生育機會。

綜上所述，中、重度少弱精子癥患者凍融精子對ICSI的可用胚胎率、優質胚胎率有一定的影響，但可以獲得與新鮮射出精子相似的妊娠結局。即便如此，對于中度、重度少弱精子癥患者在進行ICSI助孕時，作為男科大夫應該綜合考慮患者情況，再決定是否讓患者行精子冷凍保存，精子冷凍保存除了花費一定的醫療成本外，更為重要的是可能會對精子造成一定的損傷，并進一步影響胚胎質量。但是對于某些在妻子取卵日不能順利取到可用精子的患者(如隱匿精子癥者、糖尿病等疾病造成的逆行射精者、手淫取精困難者)，建議試管助孕前首選對精子進行冷凍保存。

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