瀕危植物蒙古扁桃ISSR反應體系優化

丁海麥， 白 羽， 石松利

(1.包頭醫學院基礎醫學與法醫學院，內蒙古包頭 014040； 2.包頭醫學院藥學院，內蒙古包頭 014040)

蒙古扁桃(Amygdalusmongolica)為薔薇科(Rosaceae)桃屬(Amygdalus)植物，是亞洲中部戈壁荒漠區特有的旱生落葉灌木、國家三級瀕危保護植物[1]。蒙古扁桃是荒漠區重要牧草，其葉、嫩枝、花及果實均為家畜喜食，在植被稀疏干旱少雨荒漠區，草原牧民稱之為“救命草”[2]。同時，蒙古扁桃為傳統的中藥材，以種仁入藥，性苦，味平，主治干咳、咽喉干燥、支氣管炎及陰虛便秘，還可制成止痛劑和鎮靜劑，對糖尿病、高血壓、神經衰弱、肺炎等有一定療效[3-4]。由此可見，蒙古扁桃具有廣闊的開發價值。蒙古扁桃的研究目前主要集中在有效成分提取分離、鑒定分析技術、藥理性等方面，且均取得一定成果，但對于蒙古扁桃資源的各地品種遺傳多樣性水平和遺傳結構研究仍不多。

簡單重復序列區間(inter simplese quencerepeat，簡稱ISSR)是在微衛星技術上發展起來的分子標記技術，是一種簡單高效的遺傳標記方法，具有多態性高、產物特異性強等特點[5]，該技術已廣泛應用于作物、花卉、中藥材遺傳多樣性和親緣關系研究中。ISSR原理是利用錨定的SSR-DNA作為引物進行PCR擴增，進而檢測相鄰SSR之間基因組DNA序列的差異。由于ISSR分子標記技術是基于PCR技術開發的，影響擴增結果的因素包括引物、模板DNA濃度、Mg2+濃度、dNTPs濃度、Taq酶活性等，對于不同的反應體系和擴增程序，ISSR的結果是不同的[6]。因此，為確保ISSR-PCR擴增結果的穩定和準確，需對此擴增反應體系進行優化。本研究主要針對ISSR反應體系的5個因素，在4個水平上對內蒙古包頭趙長城遺址瀕危植物蒙古扁桃進行ISSR-PCR體系優化，以期建立適合蒙古扁桃ISSR-PCR的最佳反應體系，為今后利用ISSR標記技術對蒙古扁桃資源遺傳多樣性評價和種質資源鑒定等奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

所取材料為蒙古扁桃的嫩葉，采集于內蒙古包頭市趙長城遺址。

1.2 試劑和儀器

十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)、10×PCR Buffer(Mg2+free)、MgCl2、TaqDNA聚合酶、dNTPs、ISSR引物840(5′-GAGAGAGAGAGAGAYT-3′)等，均購自生工生物工程(上海)股份有限公司；PCR儀，由Biometra公司生產；微量紫外可見分光光度計，NanoDrop；電泳儀，北京六一生物科技有限公司；凝膠成像系統，上海天能科技有限公司；離心機，上海安亭科學儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 總DNA的提取 采用改進的CTAB法提取蒙古扁桃葉基因組總DNA，采用微量紫外分光光度計及0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測所提取DNA的純度和濃度。

1.3.2 ISSR-PCR擴增反應程序 采用25 μL PCR反應體系，基本擴增程序如下：94 ℃ 10 min；94 ℃ 30 s，47 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，35次循環；72 ℃ 10 min，4 ℃保存，電泳檢測。

1.3.3 ISSR-PCR反應體系的優化 在普通PCR反應體系基礎上采用L16(45)正交設計PCR反應，對Mg2+濃度、TaqDNA聚合酶活性、dNTPs濃度、引物835濃度和DNA模板質量進行5因素4水平篩選(表1)，最終確定最佳反應體系。在總體積為25 μL的體系中，除表1中各主要因素之外，每管中加入10×PCR Buffer(Mg2+free)2.5 μL，補加ddH2O直至總體積為25 μL。其模板為趙長城遺址蒙古扁桃嫩葉基因組DNA。在PCR儀上進行擴增反應，擴增產物選用1.5%瓊脂糖凝膠電泳。電泳結束后將膠體放入凝膠成像系統中觀察并拍照保存。試驗結果參照賀石林的統計方法[7]，對ISSR-PCR擴增結果依據電泳條帶的強弱、多少及背景清晰程度進行打分，效果最佳的得16分，最差的得1分，效果居中的得 2～15分。

表1 PCR反應的L16(45)正交試驗設計

1.3.4 UBC840最佳退火溫度 依據試驗結果，將優化的反應體系在梯度PCR模式下設定退火溫度為41～53 ℃，依據PCR產物電泳結果，確定最優的退火溫度。

1.3.5 最佳反應體系驗證 選擇已篩選的ISSR引物UBC840和7個不同居群蒙古扁桃不同的樣品，檢測優化的ISSR-RCR體系及擴增程序的穩定性。

2 結果與分析

2.1 DNA檢測

用1%瓊脂糖凝膠于80 V電泳50 min，檢測所提取DNA的完整性。結果如圖1所示，可見提取的DNA樣品較純，無降解。所提取的蒙古扁桃葉DNA樣品用微量紫外可見分光光度計測得D260 nm/D280 nm值在1.80～1.85之間，符合PCR的要求。將DNA濃度稀釋至50 ng/μL備用。

2.2 ISSR-PCR反應體系的正交設計直觀分析

參照賀石林的統計方法[7]，對16個組合正交試驗結果(圖1)進行分析，根據正交試驗結果打分，效果最佳的得16分，最差的得1分，各體系得分依次為7、7、5、6、15、14、2、14、12、14、8、13、16、15、11、1分。Mg2+濃度、引物濃度、dNTPs濃度、模板DNA用量、Taq酶活性這5個因素正交試驗得分的多重比較結果(極差)分別為5.50、6.25、4.25、2.50、6.50，可見在本試驗設置的因素水平范圍內，5個因子間各水平具有不同顯著性，其影響順序依次為Taq酶活性>引物濃度>Mg2+濃度>dNTPs濃度>模板DNA用量。

2.3 同一因素內不同水平對PCR結果的影響

2.3.1 Mg2+濃度對PCR結果的影響 Mg2+對PCR擴增的特異性和產量有明顯影響。由表2可知，本試驗中Mg2+濃度對結果的影響較大，在1.5、2.0、2.5、3.0 mmol/L 4個Mg2+濃度處理之間得分均值差異明顯，且隨著Mg2+濃度的增加，得分均值在一定范圍內逐漸增大，高濃度的Mg2+降低了Taq酶活性，使反應的產物減少。因此，本試驗以2.0 mmol/L為最佳Mg2+濃度。

2.3.2Taq酶濃度對PCR結果的影響Taq酶是Mg2+依賴性酶，Mg2+濃度可影響酶的活性和專一性。由表3、圖1可知，本試驗中Taq酶濃度對結果的影響最大，不同濃度Taq酶的得分均值明顯不同。綜合考慮，本試驗以2.0 U為最佳Taq酶用量。

表2 Mg2+濃度與得分均值的關系

2.3.3 引物濃度對PCR結果的影響 引物是PCR反應體系

表3 Taq酶活性與得分均值的關系

的關鍵成分，PCR產物的特異性由引物與模板DNA的互補程度決定；引物濃度偏高可引起非特異性擴增，同時也會增加引物之間形成二聚體的機會。由表4可知，本試驗范圍內的不同引物濃度的得分均值存在明顯差異，得分均值在引物濃度為0.40～0.80 μmol/L范圍內隨著引物濃度的提高而逐漸增大。綜合考慮，本試驗以0.80 μmol/L為最佳引物濃度。

表4 引物濃度與得分均值的關系

2.4 引物840最佳退火溫度選擇

梯度PCR結果表明，溫度低時特異性較差，產生條帶相對較多，同時又缺失小片段；退火溫度較高時，引物與模板的結合性差，又造成大片段的缺失，導致PCR擴增產物譜帶數減少，同時亮度減弱。因此UBC840的最佳退火溫度范圍為第4～5泳道，最終選擇49 ℃(圖2)。

2.5 ISSR-PCR最優體系的驗證

以UBC840為引物，利用正交設計優化的蒙古扁桃 ISSR-PCR反應體系，對7份不同種質材料進行PCR擴增，得到的PCR條帶數目多且清晰，能區分7份蒙古扁桃種質(圖3)。由結果可知，優化的蒙古扁桃ISSR-PCR反應體系穩定可靠，可應用于蒙古扁桃資源遺傳多樣性評價和種質資源鑒定。

3 討論

ISSR分子標記是從SSR發展而來的，是一種微衛星標記技術[8-9]，一般每個引物可以擴增出6條左右的條帶，為保證ISSR-PCR試驗結果的重復性、穩定性，要充分考慮反應體系、擴增程序及不同物種的影響[10]。

本研究表明，在蒙古扁桃ISSR-PCR反應體系中，Taq酶、引物和Mg2+濃度是影響ISSR-PCR反應結果很重要的3個因素。Taq酶的濃度關系到PCR擴增反應的成敗，酶濃度過低時擴增速率低，條帶少且條帶模糊，甚至無擴增條帶[11]，酶濃度過高會產生非特異條帶。引物濃度對PCR擴增產物的特異性有明顯影響，濃度較高容易產生非特異條帶，濃度較低則不能擴增[12]。Mg2+作為Taq酶的輔助因子，其濃度不但影響Taq酶活性，而且可與反應體系中的dNTPs相結合，對PCR擴增產物的特異性和產量均有顯著影響，其濃度過高時，多余的Mg2+鰲合dNTPs，使dNTPs消耗殆盡，擴增產物呈現單鏈化，非特異性條帶產量增加；Mg2+濃度過低時，則由于dNTPs鰲合Mg2+降低Taq酶活性，使擴增產物減少。本研究優化后的 25 μL 反應體系如下：Taq酶活性2.0 U，引物濃度 0.80 μmol/L，Mg2+濃度2.0 mmol/L，dNTPs濃度 0.25 mmol/L，模板DNA質量50 ng。本試驗優化的ISSR-PCR體系為進一步利用ISSR技術對蒙古扁桃資源遺傳多樣性進行評價和種質資源鑒定等奠定了基礎。

[1]傅立國. 中國植物紅皮書[M]. 北京：科學出版社，1991.

[2]李愛平，王曉江，張紀鋼，等. 優良生態灌木蒙古扁桃生物學特性與生態經濟價值研究[J]. 內蒙古林業科技，2004(1)：10-13.

[3]斯琴巴特爾. 蒙古扁桃[J]. 生物學通報，2003，38(8)：51-52.

[4]郭春會，羅 夢，馬玉牟，等. 沙地瀕危植物長柄扁桃特性研究進展[J]. 西北農林科技大學學報(自然科學版)，2005，33(12)：125-129

[5]歐立軍，顏 旺，廖亞西，等. 天門冬ISSR分子標記技術的建立與體系優化[J]. 中草藥，2011，42(2)：353-357.

[6]沙 偉，王助文，曹 同. 正交設計優化縮葉蘚屬植物的ISSR-PCR反應體系[J]. 生物技術，2009，19(5)：32-34.

[7]賀石林. 中醫科研設計與統計方法[M]. 長沙：湖南科學技術出版社，1989：220.

[8]鄭素月，鄭 偉，邢志偉，等. 冀中南地區16個平菇栽培菌株的ISSR分析[J]. 江蘇農業科學，2015，43(11)：73-75.

[9]徐 君，劉鳳軍，張國芹，等. 香稻不育系ISSR正交體系優化及驗證[J]. 江蘇農業科學，2015，43(4)：21-24.

[10]何 橋，梁國魯，謝江輝. ISSR反應體系的優化與應用[J]. 果樹學報，2005，22(2)：186-189.

[11]杜金昆，姚穎垠，倪中福，等. 普通小麥、斯卑爾脫小麥、密穗小麥和輪回選擇后代材料ISSR分子標記遺傳差異研究[J]. 遺傳學報，2002，29(5)：445-452.

[12]楊 華，宋緒忠，尹光天，等. 黃藤ISSR反應體系的條件優化[J]. 福建林學院學報，2006，26(2)：152-155.