秀麗莓中鞣花酸的含量測定和抗氧化活性評測及對接研究

刁玉林,朱冬青,劉 斌

(1.北京中醫藥大學中藥學院,北京 100102；2.國家手性制藥工程技術研究中心,山東魯南制藥股份有限公司,臨沂 273400)

近年來,人們對鞣花酸的抗突變、抗癌變作用及其對化學物質誘導癌變的抑制作用進行了大量研究。在對鼠和人體組織移植所做的體內和體外實驗中,鞣花酸對化學物質誘導的癌變及其他多種癌變,特別是對結腸癌、食管癌、肝癌[1]、肺癌、舌及皮膚腫瘤、乳腺癌[2]及鼻咽癌[3]等有很好的抑制作用。除抗癌作用外,鞣花酸還有抗病毒[4]、抗菌[5]、增強免疫活性[6]、抗增殖活性[7]、DNA損傷活性[8]及抗氧化活性[9]。目前,已有一些鞣花酸的初級產品面世,效果較好。近年來,互聯網上廣泛流傳的Graviola因含有鞣花酸,能以104倍的效率殺死癌細胞,對乳癌、腸癌、肺癌、前列腺癌、食道癌、宮頸癌、皮膚癌和胰腺癌的治療有明顯效果。已有中國公司生產Graviola萃取物,產品銷往歐美國家。值得注意的是,Cozaa G等[10]以Casein kinase 2(CK2)為靶酶,與2 000種天然藥物中的活性成分進行分子對接,發現鞣花酸是CK2目前已知最強的抑制劑。綜上所述,鞣花酸是一種活性極強的有效成分,研究表明其為某些藥材的主要有效成分,而秀麗莓水煎液中含有大量鞣花酸,提示可將鞣花酸視為秀麗莓指標性成分進行研究。因此,本實驗開展了秀麗莓中鞣花酸的含量測定實驗,建立了一種高效、準確的鞣花酸定量方法,可為秀麗莓的進一步開發利用及質量控制提供實驗依據。值得注意的是,在原核和真核生物中廣泛存在著一類屬抗氧化蛋白超家族的過氧化物酶(Peroxidase)—Peroxiredoxin (Prx),該抗氧化蛋白在過氧化氫介導的信號通路調節中起重要作用。在哺乳動物細胞中,Prx家族成員能催化細胞內的過氧化氫還原,將其烷化成水和乙醇而清除[11-12]。因此,本研究首次采用計算機分子模擬的方法,選取與人類抗氧化活性相關的蛋白為受體研究對象,鞣花酸為配體,通過分子對接模擬,在分子水平上闡述其可能的作用機制并通過DPPH·抗氧化實驗對其結果進行檢驗。

1 含量測定

1.1儀器與試藥

1.1.1儀器 Waters高效液相色譜儀,配置為：1525型二元高壓梯度泵系統,2998型PDA檢測器,2414型柱溫控制系統和2707型自動進樣系統(美國Waters公司)；BT 25S型1/100 000電子分析天平(北京賽多利斯儀器有限公司)；KQ-500DE型超聲波清洗器(昆山超聲儀器有限公司)；龍尼柯UV-2000型紫外分光光度計(上海龍尼柯儀器有限公司)。

1.1.2試藥 鞣花酸對照品(南京奧多福尼生物科技有限公司,批號130412,質量分數>99.8%)。乙腈,色譜純(德國Merck公司)；蒸餾水購買于屈臣氏；DPPH·(東京化成公司)；其他試劑為分析純,購自北京北化精細化學品有限責任公司。秀麗莓采自青海互助北山,經青海省藥品檢驗所藏藥室主任羅桂法副主任藥師和北京中醫藥大學劉春生教授鑒定為薔薇科懸鉤子屬秀麗莓(RubusamabilisFocke)的干燥莖。

1.2方法與結果

1.2.1色譜條件與系統適用性實驗 色譜柱：SunFireTMC18色譜柱(150 mm×4.6 mm,5 μm)；流動相：乙腈-4 mL·L-1磷酸水溶液(20∶80)；流速：1.0 mL·min-1；檢測波長：254 nm；柱溫：35 ℃。依照上述色譜條件,精密吸取鞣花酸對照品溶液與供試品溶液各20 μL,進樣。色譜圖見圖1。由圖1可知，對照品溶液和供試品溶液所得色譜圖相應位置上,有tR(min)相同的色譜峰,且樣品中主成分色譜峰與其他干擾峰分離良好,無干擾,該方法適用于秀麗莓提取液中鞣花酸的含量測定。

1.2.2對照品溶液的制備 精密稱取鞣花酸對照品適量,加少量DMSO溶解后,加體積分數為60%的甲醇配制成鞣花酸質量濃度為20.48 μg·mL-1的溶液,即得。

1.2.3供試品溶液的制備 取秀麗莓細粉0.4 g,過40目篩,精密稱定,置于100 mL錐形瓶中,精密加入體積分數為60%的甲醇25 mL,稱定質量,超聲45 min,靜置,放冷至室溫,再稱定質量,用體積分數為60%的甲醇補足減失的質量,搖勻,以0.45 μm微孔濾膜濾過,得藥材提取液,備用[13]。

圖1HPLC圖

A.對照品；B.樣品；1.鞣花酸。

Fig.1 HPLC chromatograms

A.reference；B.sample；1.ellagic acid.

1.2.4線性關系考察 分別精密吸取鞣花酸對照品溶液4,8,12,16,18和20 μL，注入液相色譜儀,按照1.2.1項下色譜條件測定色譜峰峰面積。以進樣量(μg)為橫坐標(x)、色譜峰峰面積為縱坐標(y),進行線性擬合繪制標準曲線,計算得鞣花酸回歸方程為：y=4.798 6×106x+163 838.771 9(r=0.999 7,n=6),結果表明,鞣花酸質量在0.081 92～0.409 60 μg范圍內線性關系良好。

1.2.5精密度考察 分別精確移取供試品溶液20 μL,連續進樣6次,測定色譜峰峰面積,計算得色譜峰峰面積RSD值為0.99%(n=6),結果表明,該方法精密度良好。

1.2.6重復性考察 精密稱取同一秀麗莓細粉6份,每份0.4 g,按照1.2.3項下方法制備供試品溶液,精確移取各樣品提取液20 μL,注入液相色譜儀,測定每份藥材中的鞣花酸的色譜峰峰面積,最終計算得鞣花酸的平均含量為0.080 98%(RSD值為0.92 %),結果表明,該方法重復性良好。

1.2.7穩定性實驗 取1.2.3項下制備的試品溶液,室溫下靜置,分別于制備后0,2,4,6和8 h精確取樣20 μL,注入液相色譜儀,測定各時間點處對應的鞣花酸色譜峰峰面積,計算RSD值為1.18%。結果表明,供試品溶液在8 h內穩定性良好。

1.2.8加樣回收率實驗 精密稱取已知含量的秀麗莓細粉(鞣花酸質量分數為0.080 98%)6份,每份0.2 g,分別置于25 mL錐形瓶中,加入7.5 mL質量濃度為20.48 μg·mL-1的鞣花酸對照品溶液。按照1.2.3項下方法制得加樣回收率測定溶液,精密吸取上述溶液20 μL,注入液相色譜儀,測定色譜峰峰面積并計算鞣花酸的含量和加樣回收率。最終計算得鞣花酸的平均回收率為99.51%,RSD值為2.00%。結果見表1。

表1鞣花酸回收率實驗結果

Tab.1 Results of the recovery test of ellagic acid

樣品稱樣量/mg樣品鞣花酸含量/μg添加鞣花酸量/μg測得鞣花酸總量/mg回收率/%平均回收率/%RSD/%215.2174.269153.569320.84397.8799.512.00216.1174.998153.569323.63598.50214.6173.783153.569325.03999.29206.6167.305153.569328.580102.40204.8165.847153.569324.005101.44222.8180.423153.569325.75397.53

1.2.9樣品測定 精密稱取秀麗莓細粉3份,每份0.45 g,分別置于25 mL錐形瓶中,按照1.2.3項下方法制備樣品溶液。分別精密吸取上述待測樣品溶液和對照品溶液20和10 μL,注入液相色譜儀,測定色譜峰峰面積,采用外標一點法計算鞣花酸的含量,測得3批藥材中鞣花酸的含量分別為0.802 7‰(RSD=0.99%),0.783 8‰(RSD=0.82%)和0.785 9‰(RSD=2.25%),平均含量為0.790 8‰,提示該藥材中含有大量的鞣花酸。

2 分子模擬

2.1軟件與算法 Discovery Studio 3.5軟件,首先以LigandFit算法初步篩選適合該化合物的受體蛋白,再以CDOCKER算法分析其可能的作用機制,最終以TOPTAK模塊計算化合物的毒理學數據,對化合物進行全面評估。

2.2方法與結果 本實驗選取在Protein Data Base

(PDB)數據庫中全部與人體內抗氧化活性相關的PrxⅠ、PrxⅡ(包括屬于Ahpc/TSA系的Alkyl hydroperoxide reductase subunit C與同屬于Ahpc/TSA系,TDXH亞系的Probable peroxiredoxin)、Prx Ⅳ及PrxⅤ下的若干蛋白為受體研究對象,見表2。以鞣花酸為配體,通過LigandFit法對以上受體進行活性初篩。

表2受體選擇結果

Tab.2 Selected results of receptors

蛋白系PDB蛋白圖庫編碼PrxⅠ1QQ2,2RⅡ,2Z9S,3HY2Alkylhydroper-oxidereductasesubunitC1N8J,1TP9,1YEP,1YEX,1YF0,1YF1,2BMX,3EMP,4G2EProbableperox-iredoxin1X0R,1ZOF,2CV4,2E2G,2E2M,2NVL,2ZCT,3A2V,3A2W,3A2X,3A5WPrxⅣ2pn8,3TJB,3TJF,3TJG,3TJJ,3TJK,3TKP,3TKQ,3TKR,3TKS,3VWU,3VWV,3W8JPrxⅤ1H4O,1HD2,1OC3,1URM,2VL2,2VL3,2VL9,3MNG

在LigandFit實驗結果基礎上,對各蛋白與配體集中化合物的結合情況進行打分評價,根據一致性評分(Concensus percentage)由高至低排列篩選,最終確定結合最優的受體蛋白為1URM(Concensus percentage=100),選取維生素C為陽性對照藥物,以Prx Ⅳ系中的1URM蛋白為受體,進行模擬計算后所得結果見圖2。

圖2分子模擬結果示意圖

A.1URM蛋白結構及作用空腔位置；B.陽性藥維生素C與蛋白結構堿基空間作用；C.鞣花酸與蛋白結構堿基空間作用。

Fig.2 The sketch map of the results of molecular simulation

A.the structure of protein 1URM and the effective cavity position；B.the dimensional effects between positive drug,vitamin C and basic groups of protein；C.the dimensional effects between ellagic acid and basic groups of protein.

分析發現,受體蛋白A鏈上的Arg86堿基的HH21位點與陽性藥維生素C通過1位羰基上的氧原子間(XYZ：22.956,45.244,18.544；鍵長1.991 74 ?；Donator Hydrogen Acceptor(DHA)角141.869°；Hydrogen Acceptor Y-axis(HAY)角117.172°)；2位-OH上的氫原子與A鏈上Glu91堿基的OE1位點間(XYZ：22.714,41.389,15.748；鍵長2.262 86 ?；DHA角 127.198°；HAY角106.207°)；3位-OH上的氫原子與A鏈上Glu91堿基的OE1位點間(XYZ：21.934,40.794,15.855；鍵長2.121 26 ?；DHA角 118.012°；HAY角101.376°)及6位-OH上的氫原子與A鏈上82位甘氨酸骨架酰胺上的氧原子間(XYZ：21.555,43.157,22.052；鍵長2.192 49 ?；DHA角 144.639°；HAY角124.388°)之間形成共4個氫鍵而與受體蛋白相結合,最終起相應的抗氧化作用。

鞣花酸與該蛋白相互作用主要通過氫鍵及π-π相互作用實現：通過3位的-OH上的氫原子與受體蛋白A鏈上的82位甘氨酸骨架酰胺上的氧原子間(XYZ：21.594,43.24,22.05；鍵長2.132 29 ?；DHA角 129.146°；HAY角121.32°)；受體蛋白A鏈上的Arg86堿基HH21位與4位的氧原子間(XYZ：22.675,44.841,18.553；鍵長2.435 69 ?；DHA角145.334°；HAY角114.141°)；受體蛋白A鏈上的Gly92堿基HN位與10位羰基上的氧原子間(XYZ：19.827,38.584,15.479；鍵長2.285 29 ?；DHA角 143.958°；HAY角108.646°)形成氫鍵。同時,7,8-二羥基所在苯環與受體蛋白A鏈上的Arg95堿基NE位間(XYZ：18.889,43.08,13.577；鍵長4.650 74 ?)；10位羰基所在的苯環與受體蛋白A鏈上的Arg95堿基NE位間(XYZ：18.527,42.183,14.311；鍵長4.657 09 ?)均存在π-π相互作用,最終共同作用于該蛋白,起相應抗氧化效果。鞣花酸可與受體蛋白間形成3個氫鍵及2個π-π相互作用鍵。綜合考慮鍵長、鍵的類型與數量等因素后認為,鞣花酸的抗氧化活性較陽性藥維生素C強。

經計算,鞣花酸在全部模型中的有效可信結果為：①在NTP數據集中的雌性小鼠致癌率為0,即不致癌；②致突變性(Ames Mutagenicity)比例為0；③大鼠口服LD50值：Computed Rat Oral LD50Log (1/Moles)=2.183；Computed Rat Oral LD50=2.0 g·kg-1；Lower 95% Confidence Limits=327.7 mg·kg-1；Upper 95% Confidence Limits=10 g·kg-1；④大鼠長期口服最低毒性和不良反應水平(Lowest Observed Adverse Effect Level,LOAEL)：Computed Chronic LOAEL Log (1/Moles)=3.052；Computed Chronic LOAEL=268.1 mg·kg-1；Lower 95% Confidence Limits=51.0 mg·kg-1；Upper 95% Confidence Limits=1.4 g·kg-1；⑤皮膚刺激性(Skin Irritancy)：可能性為0,即無皮膚刺激性；⑥眼刺激性(Ocular Irritancy SEV vs MOD)可能性為0,即無眼刺激性。

3 抗氧化活性測定

3.1儀器與試藥 與1.1項下相同。

3.2方法與結果

3.2.1溶液的配制 DPPH·溶液的配制：取DPPH· 1 mg溶于20 mL無水乙醇中,超聲5 min,充分振搖使混勻，即得。取1 mL DPPH·溶液,在519 nm波長處測定吸光度值A。該DPPH·溶液避光保存,3.5 h內用完。

樣品溶液的配制：樣品以合適的溶劑溶解,為便于計算,可配成與陽性藥效果近似的質量濃度。溶劑根據樣品的極性進行選擇,如不溶可用DMSO助溶。

3.2.2數值的測定A0值的測量：取3.2.1項下制備的DPPH·溶液2 mL,置于小試管或玻璃瓶中,加甲醇1 mL,混勻,在519 nm波長處測定吸光度值A0(A0多在0.7～0.9之間)。A值的測量：取3.2.1項下制備的DPPH·溶液2 mL,加入小試管或玻璃瓶中,加樣品溶液xμL,再加(1 000-x)μL甲醇,混勻,靜置30 min后,在519 nm波長處測定吸光度值A。

3.2.3實驗方法與結果 本實驗選取維生素C為陽性藥物對照,精密稱定2.0 mg維生素C,以甲醇為溶劑配制成25 mL的儲備液(質量濃度為80 μg·mL-1),依次取該溶液40,80,120,160,200,240,280和320 μL,加入甲醇分別定容至體積為1 mL后，按照3.2.1和3.2.2項下方法進行測定。各樣品均配制成質量濃度為1 mg·mL-1的溶液,以相同方法測定,實驗結果見表3～4。

表3陽性藥維生素C的DPPH·抗氧化活性

Tab.3 The anti-oxidation effect of the positive drug vitamin C by DPPH· method (n=3)

表4鞣花酸的DPPH·抗氧化活性

Tab.4 The anti-oxidation effect of ellagic acid by DPPH· method (n=3)

根據以上數據,計算維生素C與鞣花酸的IC50值分別為8.881和3.371 μg·mL-1,可見鞣花酸的抗氧化能力為維生素C的2.6倍,與預測結果一致。

4 討論

藏藥秀麗莓為懸鉤子屬植物,該屬植物化學成分的系統研究始于20世紀70年代末80年代初,迄今為止,國內外學者已從該屬30余種植物中分離得到多種化學成分,主要包括黃酮、萜、鞣質、甾以及少量醌、有機酸、生物堿等[14]。該藥材具有清熱解毒和提高機體免疫的作用,在藏醫治療感冒、發燒、咳嗽、瘟熱病的方中,常單獨或配伍其他藥組成清熱解毒方使用[15]。目前臨床多用于預防和治療流感、肺熱咳嗽、氣喘和胃潰瘍等,療效確切可靠[16]。本課題組在前期研究中發現秀麗莓提取物中含有大量酚酸[17-18]及糖[19]類成分,提示該藥材的臨床療效極有可能與此類物質有關。基于以上實驗結果,本實驗建立了秀麗莓中鞣花酸的HPLC含量測定方法及其抗氧化活性研究。

4.1含量測定 鞣花酸的回歸方程為y=4.798 6×106x+163 838.771 9(r=0.999 7,n=6),在0.081 92～0.409 60 μg質量范圍內線性關系良好,精密度RSD=0.99%(n=6),8 h內測定峰面積RSD值為1.18%,重復性考察RSD=0.92%(n=6),平均加樣回收率為99.51%(RSD=2.00 %,n=6)。結果表明,該方法操作簡便,測定結果準確、穩定、重復性好,適用于秀麗莓中該成分含量的測定。按照該方法對3份藥材進行測定,最終測得藥材中鞣花酸的平均含量為0.790 8‰。

4.2分子模擬 本實驗證明秀麗莓水煎液中的鞣花酸可通過結構中的酚羥基以氫鍵、苯環經π-π鍵作用的方法與受體蛋白的氨基結合起效。結果顯示,該成分具有較維生素C更強的抗氧化活性,同時結合TOPTAK毒性預測結果發現,鞣花酸無致癌、致突變性且對眼無刺激性。結果表明,開發秀麗莓的保健活性應主要從秀麗莓小分子中的抗氧化活性成分——鞣花酸開展。

4.3抗氧化活性的測定 經檢測鞣花酸抗氧化活性較陽性藥物維生素C強2.6倍,從而驗證了LigandFit初步篩選結果的準確性與CDOCKER機制解釋的可信性,從而證明鞣花酸可能為該植物中最重要的抗氧化活性成分。

綜上所述,本實驗通過有機結合含量測定、計算機分子模擬及體外抗氧化活性評價,對秀麗莓水煎液中的鞣花酸進行研究,該結果可為藏藥秀麗莓中抗氧化成分鞣花酸的含量檢測及質量控制提供依據,也可為民族藥物的進一步開發提供新思路。

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