內聚能密度結合響應面法優化釀后葡萄皮渣中原花青素的提取工藝

張玉君,楊曉君,丁澤人,趙圓圓,王秋平,余壯壯

(新疆農業大學,烏魯木齊 830000)

我國為葡萄生產大國。釀后葡萄皮渣是葡萄酒產業的副產品,占釀酒葡萄總質量的20%～30%[1],多被企業丟棄或作為飼料,不僅污染環境,而且造成功能性成分和資源的浪費[2]。研究表明,葡萄的多酚類化合物主要分布于葡萄籽和皮中[3],有花色苷類、白藜蘆醇、單寧和原花青素等。這些多酚類物質具有清除自由基、抗氧化、抗癌、預防動脈硬化和降血脂等保健作用[4-6]。因此,研究葡萄皮和籽的深加工方法具有重要的科學意義和產業應用前景。

原花青素為低聚黃烷化合物的總稱,該類物質能在熱酸作用下產生花青素[7]。隨著對原花青素研究的深入,其提取成為研究熱點。目前,原花青素的提取方法主要有：傳統的有機溶劑提取法、新興技術超臨界二氧化碳提取法、微波輔助提取法、超聲波輔助提取法和酶解提取法等[8]。對于提取溶劑的選擇主要依靠參考文獻及實驗，結合生產實際,開發高效、能定量選擇以及符合原花青素品質要求的溶劑提取工藝。

內聚能密度法[9]是一種依據物質化學結構計算出微觀分子間非價鍵相互作用力大小來確定具有相近微觀分子間非價鍵相互作用力的溶劑對物質進行溶解的定量計算方法,逆向思考則為在滿足滲透條件、知道被提取物質的化學結構,用該法來預先通過計算定量確定提取劑。具體方法：先根據相似相溶和親核親電原理確定溶劑的選擇范圍,再用摩爾吸引常數，定量計算被提取物的內聚能密度和溶劑的內聚能密度,以兩者的內聚能密度數據定量配置混合提取溶劑[10]。傳統溶劑提取法一般采用相似相溶原理選擇提取溶劑,內聚能密度法確定提取溶劑能降低開發成本,縮短研究時間。本文即采用內聚能密度法對釀后葡萄皮渣中的原花青素進行提取。

1 儀器與試藥

1.1儀器 UV-2550紫外-可見分光光度計(日本島津公司)；AB204-S電子分析天平(d=0.01 mg)(梅特勒-托利多國際貿易上海有限公司)；LabTechVB50真空泵(萊伯泰科有限公司)。

1.2試藥 甲醇、無水乙醇、鹽酸,均為分析純(北京化工廠)；去離子水(實驗室自制)；原花青素對照品(大連美侖生物制劑有限公司,批號MB2168,質量分數>95%)；釀后葡萄皮渣,由新疆新天酒廠提供。

2 實驗方法

2.1內聚能密度法確定提取溶劑

2.1.1內聚能密度公式如下：

(1)

2.1.2原花青素的溶解度參數的計算

溶解度參數公式如下：

(2)

根據Small提出的基團貢獻法中的公式[11]如下：

E=Fd+Fp+Eh(Fd為色散力,Fp為極性力,Eh為氫鍵力)

(3)

對應的溶解參數方程為

δ2=δd2+δp2+δh2

(4)

(5)

原花青素分子式見圖1。由圖1可知,分子式可拆解為：羥基10個,四取代苯1個,五取代苯1個,三取代苯2個,羰基2個,亞甲基1個和次甲基1個。

圖1原花青素結構式

Fig.1 Structural formula of procyanidins

2.1.3葡萄皮渣中原花青素提取溶劑的確定

2.1.3.1提取溶劑種類的確定 根據親核親電原理和相似相溶原理,先選擇出上述各物質的提取溶劑范圍,再根據內聚能密度法越接近越易溶的原則及混合溶劑內聚能密度計算原則計算出相應的混合溶劑比例。依據相似相溶原則,原花青素提取可選擇醇類小分子溶劑和水；進一步考慮原花青素的親核親電性,提取溶劑應適度酸化；同時考慮到提取所得原花青素的使用安全及提取溶劑去除的方便性,選擇乙醇、鹽酸和水進行復配作為葡萄皮渣中原花青素的提取溶劑。具體復配的比例依照內聚能密度相近原則和溶劑混合的內聚能計算規則進行計算。

2.1.3.2提取溶劑混合比例的確定 內聚能密度相近原則是在滿足相似相溶、親核親電性相近的條件下,聚合物與溶劑的內聚能密度相近則能相互溶解,一般認為聚合物與溶劑內聚能密度差的絕對值小于1.7～2時,聚合物易溶于溶劑中。逆向思考,能使被提取物溶解分散于其中的溶劑,即可作為被提取物的提取溶劑。參考高分子物理方面的文獻[14]：

由溶劑混合的內聚能計算規則：

δ混=δV1×φ1+δV2×φ2+…+δVn×φn(φ：組分比)

(6)

則10 mL·L-1鹽酸δ=47.3×0.99+0.01×29.89=47.13；無水乙醇∶10 mL·L-1鹽酸(95∶5)δ=47.13×0.05+22.99×0.95=24.20；內聚能密度相近性判斷：∣24.20-25.73∣=1.53<1.7。

經過上述計算和混合溶劑與葡萄皮渣中原花青素內聚能密度的相近性判斷,將葡萄皮渣中原花青素的提取劑比例確定為無水乙醇∶10 mL·L-1鹽酸(95∶5)。

2.2葡萄皮渣中原花青素的提取與含量測定

2.2.1葡萄皮渣中原花青素的提取 粉碎釀后葡萄皮渣樣品,精密稱定,置于圓底燒瓶中。根據單因素實驗設計料液比,精密量取提取溶劑無水乙醇∶10 mL·L-1鹽酸(95∶5),不同溫度下水浴加熱回流一定時間,提取若干次,將提取液倒出,過濾,置于室溫中,倒入100 mL量瓶中,用無水乙醇定容至刻度。精密吸取1 mL提取液,置于25 mL棕色量瓶中,用無水乙醇定容至刻度,得到原花青素提取液,用于紫外檢測。

2.2.2葡萄皮渣中原花青素的含量測定

2.2.2.1原花青素標準曲線的制備 準確稱取干燥至恒質量的原花青素對照品20 mg,置于25 mL棕色量瓶中,加入甲醇15 mL,超聲溶解,定容,搖勻,即得質量濃度為0.8 mg·mL-1的原花青素標準儲備液。精密量取標準儲備液0,0.5,1.0,2.0,3.0,4.0和5.0 mL,分別置于10 mL棕色量瓶中,加甲醇定容,搖勻,即得質量濃度分別為0.00,0.04,0.08,0.16,0.24,0.32和0.40 mg·mL-1的標準溶液。在最大吸收波長280 nm處測定吸光度值,繪制葡萄皮渣中原花青素標準曲線,得回歸方程。

2.2.2.2樣品含量的測定 吸取葡萄皮渣中的原花青素提取液,用0.25 μm有機濾膜過濾,取濾液,甲醇作為對照品,在280 nm波長處測定吸光度值。依照回歸方程,得原花青素含量。

式中：C為原花青素提取液吸光度值帶入回歸方程中所得原花青素的質量濃度(mg·mL-1),M為釀后葡萄皮渣樣品質量(mg),V為原花青素提取液定容體積(mL),N為稀釋倍數。

2.3單因素實驗 以釀后葡萄皮渣為原料回流提取。考察料液比、提取溫度、提取時間和提取次數對釀后葡萄皮渣中原花青素含量的影響。

2.4響應面法優化釀后葡萄皮渣中原花青素的提取條件 在單因素實驗的基礎上,以其較優條件為響應面優化法的起始條件,根據Box-Benhnken組合實驗設計原理,以料液比、提取溫度和提取時間為考察因素,對釀后葡萄皮渣中原花青素的提取條件進行優化。

3 結果

3.1釀后葡萄皮渣中原花青素標準曲線的制備 以吸光度值A280為縱坐標、原花青素含量(C)為橫坐標,繪制標準曲線,得回歸方程：A280=16.026C+0.049,r=0.995 2。原花青素對照質量濃度在0～55 mg·mL-1范圍內有良好的線性關系。

3.2單因素實驗結果與分析

3.2.1料液比對釀后葡萄皮渣中原花青素含量的影響 提取溫度為45 ℃,提取時間為60 min,提取1次,設定料液比為1∶5,1∶10,1∶15,1∶20和1∶25(g·mL-1),考察釀后葡萄皮渣中原花青素含量的變化。實驗結果表明,隨著料液比的增加,原花青素含量總體呈上升趨勢,不同的料液比對原花青素含量的影響并不大,當料液比為1∶20時,原花青素的含量最高為17.39 mg·g-1。

3.2.2提取時間對釀后葡萄皮渣中原花青素含量的影響 提取溫度為45 ℃,料液比為1∶20,提取1次,設定提取時間為55,70,85,100和115 min,考察不同提取時間對釀后葡萄皮渣中原花青素含量的影響。實驗表明,隨著提取時間的升高,含量不斷增加,在提取時間為100 min時,原花青素提取效果最好,超過100 min后,原花青素含量下降。可能是隨著提取時間的增加,原花青素揮發或分解所致[15]。因此,提取時間選擇100 min進行下一步實驗。

3.2.3提取溫度對釀后葡萄皮渣中原花青素含量的影響 提取時間為100 min,料液比為1∶20,提取1次,分別設定提取溫度為45,50,55,60和65 ℃,考察不同提取溫度對釀后葡萄皮渣中原花青素含量的影響。實驗表明,提取溫度為60 ℃時,原花青素含量最高,超過60 ℃含量開始下降,可能是由于原花青素隨著提取溫度的升高而產生揮發或分解。因此,選擇60 ℃為提取溫度,進行下一步實驗。

3.2.4提取次數對釀后葡萄皮渣中原花青素含量的影響 提取時間為100 min,料液比為1∶20,提取溫度為60 ℃,分別設定提取次數為1,2,3和4次,考察不同提取次數對釀后葡萄皮渣中原花青素含量的影響。實驗表明,隨著提取次數的增加,原花青素含量也隨之增加。提取2次后含量增加不顯著,從節約提取成本考慮,選擇提取次數為2次。

3.3釀后葡萄皮渣中原花青素提取工藝的優化

3.3.1響應面實驗結果 在單因素實驗的基礎上,以料液比(A)、提取時間(B)和提取溫度(C)3個因素為自變量,原花青素含量(Y)為響應值,設計3因素3水平的實驗。實驗設計和結果見表1～2。

表1Box-Benhnken實驗設計因素和水平

Tab.1 Factors and levels in response surface design

水平因素A,料液比B,提取時間/minC,提取溫度/℃-11∶15705501∶201006011∶2513065

表2響應面分析方案及實驗結果

Tab.2 Response surface design arrangement and experimental results

實驗號ABCY/mg·g-11234567891011121314151617181920-11-11-11-11-110000000000-1-111-1-11100-1100000000-1-1-1-111110000-1100000034.5528.6429.4331.6838.7227.5337.1232.6042.8135.3245.3439.7245.4643.0146.1448.5849.5250.7051.7049.40

3.3.2模型的建立和方差分析 根據Box-Benhnken中心組合設計原理,利用Expert 8.0.6軟件,對表2中的實驗數據進行多元回歸擬合,可得料液比、提取時間和提取溫度與釀后葡萄皮渣中原花青素含量的二次多元回歸方程為：

y=242.82-13.42A-2.12B+4.61C+9.27AB-7.53AC+3.47BC-41.60A2-24.27B2-15.75C2

式中A、B、C在設計中均經過量綱線性編碼處理,各項系數的絕對值大小直接體現出各因素對響應值的影響程度大小,系數的正負反映了影響的方向。對表2的實驗結果進行統計分析,得到的方差分析結果見表3,等高線及其曲面圖見圖2～4。

表3回歸模型的方差分析結果

Tab.3 Variance analysis results of the constructed regression model

變異來源平方和自由度均方FP顯著性 模型ABCABACBCA2B2C2回歸模型失擬純誤差總和28419.341802.0444.82212.61686.91453.4696.264760.081619.78682.131496.251039.17457.0729915.5891111111111055193157.701802.0444.82212.61686.91453.4696.264760.081619.78682.13149.62207.8391.4121.1012.040.301.424.593.030.6431.8110.834.56 2.27≤0.00010.00600.59620.26080.05780.11230.44120.00020.00810.0585 0.1942**** **** 不顯著

由表3和圖2～4可知,以原花青素提取量為響應值時,P=0.006 0<0.01,表明該二次方程模型極顯著,同時失擬項P=0.194 2>0.100 0,表明正交實驗結果和數學模型擬合良好,即可用該數學模型推測實驗結果。3種因素的P值大小排序為B>C>A,即提取溫度的影響>料液比的影響>提取時間的影響。r2為0.950 0,表明模型的置信度高。各因素兩兩交互對葡萄皮渣原花青素含量的影響大小為AC>BC>AB,即料液比與提取溫度交互的影響>提取溫度與提取時間交互的影響>料液比與提取時間交互的影響。

圖2料液比和提取時間對釀后葡萄皮渣原花青素含量的交互影響

Fig.2 The reciprocal effect of solid-liquid rate and extraction time on the procyanidins content from brewed grape skin residue

圖3料液比和提取溫度對釀后葡萄皮渣原花青素含量的交互影響

Fig.3 The reciprocal effect of solid-liquid rate and extraction temperature on the procyanidins content from brewed grape skin residue

圖4提取時間和提取溫度對釀后葡萄皮渣原花青素含量的交互影響

Fig.4 The reciprocal effect of extraction time and extraction temperature on the procyanidins content from brewed grape skin residue

在內聚能密度法計算葡萄皮渣原花青素提取溶劑的基礎上,通過Expert 8.0.6軟件進行響應面工藝優化,得到葡萄皮渣中原花青素提取的優化工藝為：提取溫度為60 ℃,提取時間為100 min,料液比為1∶20。

3.4葡萄皮渣中原花青素提取優化工藝的驗證 取釀后葡萄皮渣樣品,粉碎,精密稱定5 g,置于圓底燒瓶中,精密量取提取溶劑無水乙醇∶10 mL·L-1鹽酸(95∶5)100 mL,60 ℃水浴加熱100 min,平行提取2次,倒出釀后葡萄皮渣提取液,過濾,放冷至室溫,倒入100 mL量瓶中,用提取溶劑定容,得到釀后葡萄皮渣中原花青素提取液。按照2.2.2項下方法進行葡萄皮渣中原花青素含量測定,得原花青素平均含量為49.39 mg·g-1(n=3,RSD=1.7%)。

4 討論

目前,原花青素提取溶劑主要有：甲醇、乙醇、丙酮和乙酸乙酯[16]。溶劑的選擇及配比都是根據參考文獻或均勻實驗選取,耗時長、成本高、效率低。本實驗依據相似相溶和親核親電原理,同時考慮食用藥用安全性,確定溶劑的選擇范圍,再根據內聚能密度法,用摩爾吸引常數定量計算出原花青素的內聚能密度和提取溶劑的內聚能密度,篩選得提取溶劑無水乙醇和10 mL·L-1鹽酸溶液,以兩者的內聚能密度數據定量配制混合提取溶劑,得兩者配比為無水乙醇∶10 mL·L-1鹽酸(95∶5)。克服了提取溶劑選擇的經驗性和不確定性。本實驗采用的內聚能密度法提取的原花青素平均含量為49.39 mg·g-1,高于文獻方法提取的含量,如陳月英等[17]采用微波輔助提取法的原花青素含量為9.12 mg·g-1,采用酶法提取工藝提取的原花青素含量為11.08 mg·g-1[18]；王竹清等[19]采用乙醇浸提法提取的原花青素含量為2.67 mg·g-1。此法比酶解法、微波輔助提取法更經濟,相對于一般的溶劑提取法,能更快地找到合適的提取試劑。因此,該方法也為其他天然產物成分的溶劑提取提供了有力的理論依據。

本文在單因素實驗的基礎上,將響應面法應用于釀后葡萄皮渣中原花青素的提取。實驗結果表明,提取溫度、料液比和提取時間的平方項對原花青素含量有顯著影響,說明提取溫度、料液比、提取時間與原花青素含量的影響不是簡單的線性關系。

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