大黃素通過自噬抑制血管平滑肌細胞的增殖和遷移

權 彥,李小蓉,趙忠孝,劉靖麗,張 朋

(陜西中醫藥大學,咸陽 712046)

動脈粥樣硬化是引起心腦血管疾病死亡的主要原因。血管平滑肌細胞(VSMC)增殖與遷移在動脈粥樣硬化形成中起著關鍵作用[1]。研究發現,白藜蘆醇、丹參和黃芪甲苷等[2]均可抑制血管平滑肌細胞的增殖遷移。

大黃素(emodin)是存在于大黃屬、蓼屬、鼠李屬植物和番瀉葉中的游離型蒽醌類成分,具有多種藥理作用[3-4]。研究發現,大黃素具有抑制腫瘤細胞增殖和遷移的作用[5]。郭丹杰等[6]首次提出中藥純品大黃素劑量依賴性抑制兔髂動脈血管平滑肌細胞增殖。文獻證實大黃素對家兔離體主動脈平滑肌細胞和人臍動脈血管平滑肌細胞增殖的抑制作用存在明顯質量濃度依賴性[7-8]。然而，大黃素對大鼠胸主動脈VSMC增殖遷移作用還未被闡明。

細胞自噬(autophagy) 是一種維持細胞內環境穩態的機制[9]。近年來較多研究集中在自噬與增殖遷移調控的關系上[10]。目前發現自噬激活對肝癌HepG2細胞和舌鱗癌細胞的增殖遷移均具有抑制作用[11]。雷帕霉素抑制SD大鼠的腹主動脈離體血管平滑肌細胞增殖與自噬激活有關[12]。目前,關于自噬在大黃素對細胞增殖遷移抑制過程中的作用報道較少。

本實驗以大鼠胸主動脈血管平滑肌細胞為研究對象,研究大黃素對大鼠胸主動脈血管平滑肌細胞增殖遷移的抑制作用并初步探討其作用機制。

1 儀器與材料

1.1儀器 超凈工作臺(蘇州安泰空氣技術有限公司)；CO2培養箱(美國Thermo公司)；倒置顯微鏡(重慶光學儀器廠)；全波段酶標儀,SDSPAGE微型凝膠電泳儀,化學發光成像儀,Quantity One Software圖像分析系統(均購自伯樂生命醫學產品(上海)有限公司)。

1.2試藥 大黃素由陜西賽德高科技生物股份公司提供,經HPLC鑒定質量分數>95%；DMEM培養基、新生牛血清(美國Gibco公司)；3-甲基腺嘌呤(3-MA) (德國Sigma 公司)；LC3,Beclin1,PCNA和β-actin抗體 (美國Cell Signaling Technology公司)；CCK8試劑盒(日本同仁會社)；HRP(美國 Santa Cruz公司)。

1.3動物 健康雄性 SD大鼠,體質量為150～200 g,購于西安交通大學醫學部實驗動物中心,合格證號：SYXK(陜)2014-003。

2 方法

2.1細胞培養 選取體質量為150～200 g的健康雄性SD大鼠,腹腔注射麻醉藥。取大鼠胸腹主動脈,剔除外周結締組織,用預冷的PBS沖洗3次后,剝離血管中膜層,剪碎,貼塊法培養VSMC,整個操作過程保持無菌。細胞在含100 mL·L-1胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)、100 U·mL-1青霉素和100 [μg·mL-1]鏈霉素的DMEM培養基中,于體積分數為5%的CO2和37 ℃條件下培養,取3～7代進行實驗[13]。

2.2CCK8法 取對數生長期大鼠主動脈血管平滑肌細胞,制成單細胞混合液,調整密度為1×104個·mL-1,接種于96孔板,每孔含200 μL細胞混懸液,設置6個復孔,常規培養。待細胞密度生長至60%～80%時,分別加入含不同質量濃度大黃素(0,5,10,20,40和80 μg·mL-1)的DMEM(含10 mL·L-1FBS) 200 μL刺激細胞,同時設空白調零組(不加細胞僅加入等量的DMEM)及TGF-β1(5[ng·mL-1)]刺激的陽性藥物組。藥物處理24 h后每孔加入CCK8溶液,在37 ℃培養箱中孵育 2 h。用酶標儀于450 nm波長條件下測定吸光度值A,計算細胞抑制率,實驗重復3次。

細胞增殖抑制率(%)=[1-(實驗組A450值-空白調零組A450值)/(對照組A450值-空白調零組A450值)]×100%

2.3劃痕實驗法 將對數生長期的VSMC消化混勻為1×104個·mL-1細胞混懸液,接種1 mL于24孔板,在含10 mL·L-1FBS的 DMEM中培養細胞至90%～95%混合。用200 μL無菌槍頭在孔中劃出直徑為3 mm的平直劃痕,PBS 沖洗后換含不同質量濃度大黃素(0,5,10,20,40和80 μg·mL-1)的DMEM及TGF-β1(5 ng·mL-1)刺激的陽性藥物,繼續培養24 h。在倒置顯微鏡下觀察劃痕情況,拍照，每個孔至少拍照3個點,每組實驗至少重復3次。

2.4蛋白印跡法 各組細胞經相應給藥處理后,預冷PBS漂洗2次,每孔加入150 μL RIPA 和 1 μL PMSF,冰上裂解20 min,以12 000 r·min-1離心15 min,吸取上清液。采用BCA法進行蛋白定量檢測。熱變性后,取30 μg總蛋白在聚丙烯酰胺梯度凝膠電泳分離,電轉至PVDF膜上,0.5 g·L-1脫脂奶粉室溫封閉4 h。一抗(LC3II/I,Beclin-1,PCNA和β-actin)4 ℃孵育過夜。TBST緩沖液洗膜3次,每次10 min,加入辣根過氧化物酶標記的相應 IgG二抗(工作液質量濃度為1∶5 000)室溫孵育1～2 h。最后將漂洗后的PVDF膜上加發光底物顯影液曝光顯影,置于凝膠成像系統進行圖像采集。用Quantity One 4.31凝膠蛋白分析軟件對條帶進行灰度分析。

3 結果

3.1不同質量濃度大黃素對VSMC增殖的影響 CCK8法和免疫印跡法檢測不同質量濃度大黃素對VSMC增殖的影響,應用不同質量濃度(5,10,20,40和80 μg·mL-1)大黃素刺激VSMC 24 h。CCK8法結果顯示,與空白對照組比較,TGF-β1(5 ng·mL-1)可明顯促進VSMC增殖,而大黃素可抑制VSMC增殖,隨著質量濃度增加抑制率顯著增加,在質量濃度為40 μg·mL-1時抑制作用最明顯,抑制率達50.9%～60.6%。同時,采用免疫印跡法檢測增殖蛋白PCNA的表達變化,結果發現,大黃素呈質量濃度依賴性抑制VSMC中增殖蛋白PCNA的表達,且在質量濃度為40 μg·mL-1時抑制效果最強,質量濃度為80 μg·mL-1時抑制率有所下降,可能與其高質量濃度導致細胞死亡有關。見圖1。

圖1不同質量濃度大黃素對VSMC增殖的影響

A.CCK8法檢測細胞抑制率；B.免疫印跡法檢測PCNA蛋白表達水平。與對照組比較*P<0.05,**P<0.01。

Fig.1 The effect of emodin on the proliferation of VSMC

1.the cell viability determined by CCK8 assay；B.the protein expression of PCNA determined by Western Blotting.*P<0.05,**P<0.01 vs the control group.

3.2不同質量濃度大黃素對VSMC遷移的影響 采用劃痕實驗法檢測不同質量濃度大黃素對VSMC遷移的影響。結果見圖2。由圖2可知，TGF-β1(5 ng·mL-1)可明顯促進VSMC遷移,而隨著大黃素質量濃度依次增加,劃痕愈合程度明顯減弱,各質量濃度組細胞遷移率差異均具有統計學意義。結果表明,大黃素可質量濃度依賴性地抑制VSMC的遷移,且質量濃度為40 μg·mL-1時細胞抑制率最低。

圖2不同質量濃度大黃素對VSMC遷移的影響

A.各組24 h細胞劃痕實驗圖片；B.各組24 h細胞劃痕實驗遷移率。劃痕實驗法檢測細胞遷移。與對照組比較*P<0.05,**P<0.01。

Fig.2 The effect of emodin on the migration of VSMC

A.24 h cell scratch test pictures in each group; B.Migration rate of scratch test of 24 h cells in each group.The migration determined by wound healing assay.*P<0.05,**P<0.01 vs the control group.

3.3不同質量濃度大黃素對VSMC自噬的影響 為初步探討細胞自噬是否參與大黃素對VSMC細胞增殖遷移的調控過程,應用不同質量濃度大黃素刺激VSMC細胞24 h后,提取細胞總蛋白,免疫印跡法檢測自噬相關蛋白LC3和Beclin1的表達。與對照組比較,TGF-β1可明顯促進VSMC自噬蛋白LC3和Beclin1的表達,且隨著大黃素質量濃度增加,LC3和Beclin1蛋白表達水平明顯增強,結果表明,大黃素抑制VSMC增殖遷移過程中,可質量濃度依賴性地上調細胞自噬。見圖3。

圖3不同質量濃度大黃素對VSMC細胞自噬的影響

A.免疫印跡法檢測LC3蛋白表達水平；B.免疫印跡法檢測Beclin1蛋白表達水平。與對照組比較*P<0.05,**P<0.01。

Fig.3 The effect of emodin on the autophagy of VSMC

A.the protein expression of LC3 determined by Western Blotting；B.the protein expression of Beclin1determined by Western Blotting.*P<0.05,**P<0.01 vs the control group.

3.4大黃素通過細胞自噬抑制VSMC的增殖 為進一步研究大黃素是否通過細胞自噬抑制VSMC的增殖遷移。我們采用自噬抑制劑3-MA(5 mM)預處理細胞1 h,40 μg·mL-1大黃素刺激細胞24 h。見圖4。CCK8法結果顯示,與對照組比較,40 μg·mL-1大黃素明顯抑制VSMC增殖；而與40 μg·mL-1大黃素處理組比較,3-MA預處理后,大黃素對VSMC的抑制作用明顯減弱,差異均具有統計學意義(P<0.05)。免疫印跡法檢測增殖蛋白PCNA的表達水平,其變化與CCK8法檢測結果一致。

3.5大黃素通過細胞自噬抑制VSMC的遷移 研究采用自噬抑制劑3-MA(5 mM)預處理細胞1 h,40 μg·mL-1大黃素刺激細胞24 h。見圖5。與單獨40 μg·mL-1大黃素處理組比較,抑制細胞自噬后,大黃素對VSMC的遷移抑制作用明顯減弱。綜上所述,大黃素抑制VSMC的增殖遷移作用是通過細胞自噬實現的。

圖4大黃素通過細胞自噬抑制VSMC的增殖

A.CCK8法檢測細胞抑制率；B.免疫印跡法檢測PCNA蛋白表達水平。與對照組比較*P<0.05,**P<0.01；與大黃素組比較#P<0.05。

Fig.4 Emodin inhibits the proliferation of VSMC through autophagy

A.the cell viability determined by CCK8 assay；B.the protein expression of PCNA determined by Western Blotting.*P<0.05,**P<0.01 vs the control group;#P<0.05 vs the emodin group.

圖5大黃素通過細胞自噬抑制VSMC的遷移

A.各組24 h細胞劃痕實驗圖片；B.各組24 h細胞劃痕實驗遷移率。劃痕實驗法檢測細胞遷移。與對照組比較*P<0.05,**P<0.01;與大黃素組比較#P<0.05。

Fig.5 Emodin inhibits the proliferation of VSMC through autophagy

A.24 h cell scratch test pictures in each group; B.Migration rate of scratch test of 24 h cells in each group.The migration determined by wound healing assay.*P<0.05,**P<0.01 vs the control group;#P<0.05 vs the emodin group.

4 討論

VSMC的增殖遷移可能是造成動脈粥樣硬化性疾病的病理學基礎。研究發現,多酚類化合物原花青素能夠顯著抑制VSMC的增殖與遷移。據報道,大黃素對某些以細胞增殖、遷移及凋亡為主要病理改變的疾病具有潛在的治療作用[14]。大黃素可有效抑制大鼠膠質細胞瘤、乳腺癌、人胰腺癌Panc-1細胞等生長及高糖誘導的大鼠 GMC增殖等。據此,我們首次采用原代培養的大鼠胸主動脈VSMC對大黃素增殖遷移的作用進行研究。實驗結果顯示,隨著大黃素給藥質量濃度的增加,其對VSMC的增殖和遷移的抑制作用逐漸增強。表明大黃素呈質量濃度依賴性抑制VSMC的增殖遷移,其機制有待進一步探討。

基礎水平的血管平滑肌細胞自噬[15]延緩動脈粥樣硬化病變的進程,提示細胞自噬可能參與調控血管平滑肌細胞增殖與遷移[16]。觀察不同質量濃度大黃素抑制VSMC增殖遷移作用的過程中,細胞自噬水平上調。此結果與張佩佩等提出的雷帕霉素的抑制VSMC增殖作用與自噬激活有關結論一致。研究再采用自噬特異性抑制劑3-MA抑制自噬。結果顯示,單獨40 μg·mL-1大黃素可抑制細胞增殖[17-18],3-MA預處理VSMC后大黃素對VSMC增殖遷移的抑制作用明顯減弱,說明大黃素抑制VSMC的增殖遷移是通過細胞自噬完成。

綜上所述,我們發現大黃素可通過細胞自噬抑制VSMC的增殖遷移。由此可知,大黃素對防治動脈粥樣硬化性及血管狹窄等血管病變的發生發展具有臨床價值,本研究對于研究自噬在細胞增殖遷移中的調控也具有重要意義。

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