硝苯地平緩釋微丸在Beagle犬體內(nèi)的藥動學及生物等效性

肖正林,丁勁松

(1.湘潭市中心醫(yī)院藥學部,湘潭 411100；2.中南大學藥學院 長沙 410013)

硝苯地平(nifedipine)作為第1個二氫吡啶類鈣通道阻滯劑,由德國拜耳公司于1969年首次合成并成功上市,目前是用于口服治療高血壓和心絞痛的首選藥物之一[1-4]，其普通短效(4～8 h)制劑給藥頻繁,個體差異性及血藥濃度波動大,大劑量使用時可產(chǎn)生心律失常,增加心臟猝死的危險性[5]；而長效緩控釋制劑給藥頻次每日1～2次,藥效平穩(wěn),可有效減輕上述不良反應的發(fā)生,用藥安全性和依從性更好[6-7]。本文前期研究中[8],以硝苯地平為模型藥物,采用流化床上藥法制備含藥素丸,并以 Eudragit?RL、RS緩釋膜材包衣制備硝苯地平緩釋微丸,以減少給藥頻次、平穩(wěn)血藥濃度、降低不良反應的發(fā)生率,從而提高臨床用藥的依從性。通過已上市產(chǎn)品Coracen?為對照,比較Beagle犬服用硝苯地平緩釋微丸和Coracen?后的體內(nèi)藥動學行為,旨在證明硝苯地平緩釋微丸具有良好的緩釋效果,同時為新劑型的研究和臨床合理用藥提供參考。

1 儀器與材料

1.1儀器 API3000型三級四極桿液質聯(lián)用儀(AB SCIEX公司)；TGL-16M低溫高速離心機(長沙英泰儀器有限公司)；BS 224S萬分之一天平(德國賽多利斯公司)；TDD-5M型多管低速離心機(長沙英泰儀器有限公司)；MTN-2800D氮吹儀(AUTO SCIENCE公司)；TARGINTM VX-Ⅱ渦旋振蕩儀(北京踏錦科技有限公司)；WH-2微量旋渦混合儀(上海滬西分析儀器廠)；KL-up-Ⅱ-10型超純水機(臺灣艾柯公司)。

1.2材料 硝苯地平對照品(批號136515,質量分數(shù)>99.7%,山西臨汾寶珠制藥有限公司)；地西泮對照品(批號100326,質量分數(shù)>99.5%,中國食品藥品檢定研究院)；硝苯地平緩釋微丸(自制,規(guī)格為20 mg)；硝苯地平緩釋膠囊Coracen?(參比制劑,規(guī)格為20 mg,英國優(yōu)時比制藥有限公司)；其余試劑均為分析純。

1.3動物 Beagle犬6只,雌雄各半,均由湖南省實驗動物中心提供,合格證號：SCXY(湘)2013-0021。

2 方法與結果

2.1實驗方案及血樣采集 采用自身交叉單劑量口服給藥。6只Beagle犬編號1～6,隨機分為2組,每組3只。給藥前禁食12 h,分別給予硝苯地平緩釋微丸或上市緩釋膠囊各1粒,于給藥后0,0.5,1,1.5,2,4,6,8,10,12和24 h分別取前腿靜脈血5 mL,以3 000 r·min-1離心15 min,取上層血清,于-20 ℃避光保存。

2.2血漿樣品處理 精密吸取血樣500 μL,置于10 mL具塞離心管中,加入內(nèi)標溶液(1 μg·mL-1地西泮溶液)50 μL和1 mol·L-1氫氧化鈉溶液50 μL,混勻,加入3 mL乙醚,渦旋3 min,以3 000 r·min-1離心12 min,取上層清液2.4 mL,40 ℃氮氣揮干,加入流動相150 μL復溶,渦旋1 min,以12 000 r·min-1離心10 min,取上清5 μL,進樣分析。

2.3儲備液的配制 硝苯地平對照品儲備液的配制：精密稱取硝苯地平對照品10 mg,置于100 mL量瓶中,適量甲醇超聲溶解,甲醇定容至刻度,搖勻,即得質量濃度為100 μg·mL-1的硝苯地平對照品儲備液(1)。精密吸取上述對照品儲備液(1)1 mL,置于100 mL量瓶中,用甲醇定容至刻度,搖勻,即得質量濃度為1 μg·mL-1的硝苯地平對照品儲備液(2),于4 ℃避光保存,備用。

地西泮內(nèi)標儲備液的配制：精密稱取地西泮對照品10 mg,置于100 mL量瓶中,適量甲醇超聲溶解,用甲醇定容至刻度,搖勻,即得質量濃度為100 μg·mL-1的地西泮對照品儲備液(1)。精密吸取上述對照品儲備液(1)1 mL,置于100 mL量瓶中,甲醇定容至刻度,搖勻,即得質量濃度為1 μg·mL-1的地西泮對照品儲備液(2),于4 ℃避光保存,備用。

2.4體內(nèi)藥動學研究

2.4.1色譜和質譜條件 色譜柱：Symmetry C18柱(50 mm ×2.1 mm,5 μm)；流動相：3 mL·L-1甲酸-甲醇(38.5∶61.5)；流速：0.3 mL·min-1；柱溫：30 ℃；進樣量：5 μL。

質譜條件：電噴霧離子源(ESI),正離子模式,多反應MRM監(jiān)測,質譜參數(shù)為：硝苯地平：[M+H]+347.3(m/z)→315.2(m/z),DP：46 V,FP：293 V,EP：8 V,CE：14 eV,CXP：15 V；地西泮：[M+H]+285.0(m/z)→193.2(m/z),DP：82 V,FP：295 V,EP：8 V,CXP：8 V,CE：48 eV。離子源參數(shù)：Nebulizer Gas：13 Psi；Collision Gas：4 Psi；Curtain Gas：8 Psi；Gas 2：7 000 Psi；Temperature：500 ℃；Ion Spray Voltage：5 000 V。

2.4.2專屬性 分別取6份不同來源的空白血漿、空白血漿+藥物(10 ng·mL-1)和1號犬給藥后2 h血樣,按照2.2項下方法處理后進樣分析,記錄色譜圖。見圖1。由圖1可知,在該測定條件下,硝苯地平和地西泮的保留時間分別為1.6和2.6 min,血漿內(nèi)源性物質不干擾兩者的測定。

2.4.3標準曲線的繪制 取硝苯地平對照品儲備液(2),用甲醇稀釋為質量濃度為1 000,500,250,100,50,25和10 ng·mL-1的標準工作溶液。分別吸取上述溶液50 μL,精密加入空白血漿450 μL,渦旋1 min,依次配制藥物質量濃度為100,50,25,10,5,2.5和1 ng·mL-1的硝苯地平標準血樣。按照2.2項下方法處理后進樣分析,記錄色譜圖,以硝苯地平和地西泮的峰面積比值為縱坐標y、血漿中硝苯地平質量濃度為橫坐標x進行線性回歸,得線性方程：y=2.43×10-2x+1.76×10-3,r=0.999 7,權重系數(shù)為1/C2。結果表明,硝苯地平在血漿樣品中質量濃度為1～100 ng·mL-1范圍內(nèi)線性關系良好。該條件下血漿中硝苯地平的最低檢測限為1 ng·mL-1。

圖1LC-MS/MS法測定Beagle犬血漿中硝苯地平色譜圖

A.空白血漿；B.空白血漿+藥物(tR=1.6 min,10 ng·mL-1)+內(nèi)標(tR=2.6 min,1 μg·mL-1)；C.1號犬第1周期給藥后2 h血樣+內(nèi)標(tR=2.6 min,1 μg·mL-1)；1.硝苯地平；2.地西泮。

Fig.1 LC-MS/MS chromatograms of nifedipine in Beagle dogs plasma

A.blank plasma；B.blank plasma sample+nifedipine(tR=1.6 min,10 ng·mL-1)+internal standard(tR=2.6 min,1 μg·mL-1)；C.plasma sample of 2 h from No.1 Beagle dog after given drugs for the first period+internal standard(tR=2.6 min,1 μg·mL-1)；1.nifedipine；2.diazepam.

2.4.4絕對回收率 用空白血漿配制含硝苯地平高、中和低質量濃度(80,25和2.5 ng·mL-1)的標準血漿樣品各5份,按照2.2項下方法處理后進樣分析。另取甲醇配制硝苯地平高、中和低質量濃度(80,25和2.5 ng·mL-1)各5份,同上操作,進樣并分析,由二者峰面積比值計算絕對回收率。結果發(fā)現(xiàn),血漿中高、中和低質量濃度的絕對回收率分別為97.7%,108.0%和92.7%。

2.4.5基質效應 取空白血漿50 μL,加入200 μL流動相,渦旋、離心,取上清液備用。另取高、中和低(80,25和2.5 ng·mL-1)3個質量濃度的硝苯地平甲醇溶液各50 μL,分別平行配制5份。加入質量濃度為1 μg·mL-1的內(nèi)標溶液50 μL,加入上述上清液150 μL,渦旋,取上清液,進樣分析。另取高,中和低(80,25和2.5 ng·mL-1)3個質量濃度的硝苯地平甲醇溶液各50 μL,分別平行配制5份。加入質量濃度為1 μg·mL-1的地西泮溶液50 μL,加入流動相150 μL,渦旋混勻,取上清液,進樣分析,由二者峰面積比值計算基質效應。結果發(fā)現(xiàn),高、中和低質量濃度硝苯地平血漿樣品的基質效應在87.0%～96.6%之間,滿足生物樣品測定方法學的要求。

2.4.6精密度和準確度 用空白血漿配制含硝苯地平高、中和低質量濃度(80,25和2.5 ng·mL-1)的標準血漿樣品各5份,按照2.2項下方法處理后進樣分析,連續(xù)測定3 d,計算不同質量濃度的日內(nèi)、日間精密度和準確度。結果表明,高、中和低質量濃度硝苯地平血漿樣品的日內(nèi)、日間的精密度均不超過9.9%,準確度為87.5%～97.8%,滿足生物樣品測定方法學的要求。

2.4.7穩(wěn)定性 用空白血漿配制含硝苯地平高、中和低質量濃度(80,25和2.5 ng·mL-1)的標準血漿樣品各5份,分別考察血漿樣品在室溫、反復凍融、長期凍存(-20 ℃)以及處理液室溫條件下的穩(wěn)定性。結果表明,血漿中硝苯地平在考察條件下均穩(wěn)定。

2.5藥-時曲線及藥動學參數(shù)研究 6只Beagle犬單劑量灌服20 mg硝苯地平緩釋微丸與Coracen?后,繪制得到的血藥質量濃度-時間曲線見圖2,采用DAS 3.0藥動學軟件處理血藥質量濃度數(shù)據(jù),以非房室模型法計算曲線下面積AUC,根據(jù)藥-時曲線末端4個點進行線性回歸,求得消除速率常數(shù)Ke。藥動學參數(shù)及相對生物利用度(F)見表1。

2.6體內(nèi)外相關性評價 對硝苯地平緩釋微丸的血藥質量濃度數(shù)據(jù)進行室模型擬合,權重系數(shù)為1/C2,以AIC法和擬合優(yōu)度R2法判別隔室模型。結果表明,硝苯地平緩釋微丸的體內(nèi)吸收過程符合單室模型,與文獻報道一致[9-11],見表2。

表1Beagle犬口服硝苯地平緩釋微丸和Coracen?后的藥動學參數(shù)

Tab.1 The main pharmacokinetic parameters of nifedipine in Beagle dogs after orally administrated Nifedipine Sustained-release Pellets and Coracen?

參數(shù)Coracen 硝苯地平緩釋微丸Cmax/ng·mL-128.72±4.8827.11±2.87Ke/h-10.23±0.020.21±0.02t1/2/h4.67±1.025.03±1.16tmax/h3.67±0.523.83±0.41MRT0-t/h5.97±0.416.72±0.29AUC0～t/ng·h·mL-1155.41±23.11164.99±20.32AUC0～∞/ng·h·mL-1164.43±23.41170.81±19.99F/%-103.9

表2硝苯地平緩釋微丸藥動學模型判斷

Tab.2 Pharmacokinetic model judgement of Nifedipine Sustained-release Pellets in Beagle dogs

項目123456Mean單室AIC-7.28-6.32-5.78-6.95-4.39-5.92-6.11R20.990.991.000.980.990.980.99雙室AIC-3.21-2.97-3.15-4.18-2.58-2.46-3.09R20.980.970.990.980.990.970.98

采用Wagner-Nelson法計算硝苯地平緩釋微丸的吸收分數(shù)Fa(%)[12]。對不同時間點體內(nèi)吸收分數(shù)Fa(%)與在釋放介質為0.02 mol·L-1十二烷硫酸鈉溶液、轉速為100 r·min-1、溫度為37±0.5 ℃條件時,相同時間體外累積釋放分數(shù)Fr(%)進行線性回歸,得線性方程Fa=1.259Fr+2.26(R=0.99,P<0.01),表明硝苯地平緩釋微丸體內(nèi)外相關性良好,見表3。

表3硝苯地平緩釋微丸的體內(nèi)外相關性

Tab.3 Theinvivoandinvitrocorrelation of Nifedipine Sustained-release Pellets

t/hCtKeCt+Ke×AUC0～tKe×AUC0～∞Fa/%Fr/%0------13.740.214.0535.8711.719.8329.400.2110.1735.8728.3420.57422.300.2124.6735.8768.7845.92613.880.2132.1335.8789.5766.2788.690.2135.8235.8799.8683.50

2.7生物等效性分析 利用SPSS 19.0對主要藥動學參數(shù)經(jīng)對數(shù)轉換后進行統(tǒng)計分析,分別采用方差分析、雙單側t檢驗及(1-2α)置信區(qū)間法對硝苯地平緩釋微丸和Coracen?進行生物等效性判定。

2.7.1方差分析法 對硝苯地平緩釋微丸和Coracen?的AUC0～24 h和Cmax進行對數(shù)轉換后,進行方差分析。結果顯示,lnAUC0～24 h在制劑間、組間和個體間的方差分別為1.203,0.865和27.159；lnCmax在制劑間、組間和個體間的方差分別為0.634,1.216和12.297,經(jīng)統(tǒng)計分析表明,lnAUC0～24 h、lnCmax的制劑間、周期間差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05),lnCmax的個體間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),lnAUC0～24 h在個體間差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

2.7.2雙單側t檢驗和(1-2α)置信區(qū)間考察 采用雙單側t檢驗和(1-2α)置信區(qū)間法考察硝苯地平緩釋微丸和Coracen?的主要藥動學參數(shù)(lnAUC0～24 h、lnCmax)的差異是否在允許范圍內(nèi),結果顯示,硝苯地平緩釋微丸的lnAUC0～24 h的t1和t2分別為2.732和2.463；lnCmax的t1和t2分別為2.609和2.454,兩參數(shù)均大于臨界值t0.95(4)=2.132,90%CI分別為(88.3～121.6)%和(79.6～133.5)%,結果表明，硝苯地平緩釋微丸與Coracen?生物等效。

3 討論

3.1體內(nèi)分析方法的建立 文獻報道[13],單劑量口服硝苯地平控釋片(30 mg)后,Cmax僅為27.5±15.9 ng·mL-1,血藥質量濃度極低,硝苯地平體內(nèi)分析方法較多[14-19],最早使用的熒光法對血漿中硝苯地平質量濃度進行監(jiān)測時[16],利用硝苯地平分子結構中二氫吡啶母環(huán)在氧化成吡啶環(huán)后產(chǎn)生熒光特征進行測定,操作較繁瑣、費時,樣品需事先經(jīng)氧化處理,且該方法靈敏度低,不符合藥物質量濃度測定的要求。其次,硝苯地平化學結構中的二氫吡啶母環(huán)在高溫下不穩(wěn)定,應用GC法分析時需程序升溫[17],對實驗結果帶來一定影響。HPLC法[18]能夠滿足硝苯地平血樣的測定要求,但樣品分析時間較長,不利于大批量樣品的測定。

本研究采用LC-MS/MS法測定Beagle犬血漿中硝苯地平的質量濃度,以地西泮為內(nèi)標,與其他分析方法相比,靈敏度大大提高(LLOQ為1 ng·mL-1)的同時,分析準確、快速,藥物和內(nèi)標的保留時間僅為1.6和2.6 min,提高了分析效率,適用于大批量血樣的測定。

3.2體內(nèi)外相關性 胃腸道環(huán)境相對于體外釋放度條件更為復雜[20],緩控釋制劑釋藥性質的評價最終應以體內(nèi)吸收情況為標準。考察藥物體內(nèi)外相關性,可以在體外預測藥物在體內(nèi)的釋放情況從而使體外評價更加科學合理,達到簡化制劑體內(nèi)評價過程的目的。

硝苯地平緩釋微丸在體內(nèi)吸收過程符合單室模型,可采用Wagner-Nelson法計算其體內(nèi)吸收分數(shù),基于體外累積釋放分數(shù)可考察二者的相關性,結果表明,微丸體內(nèi)外相關性良好,證實可通過體外釋放度實驗來表征藥物在體內(nèi)的吸收過程。由于硝苯地平緩釋微丸與Coracen?犬體內(nèi)生物等效,因此以其建立IVIVC模型而制定的體外釋放標準更為科學和合理。

3.3生物等效性 藥動學研究中,硝苯地平緩釋微丸與上市產(chǎn)品Coracen?的主要藥動學參數(shù)無顯著性差異,經(jīng)雙單側t檢驗和90%CI法分析表明,兩制劑生物等效,提示以Eudragit?RL/RS為包衣膜材制備的硝苯地平緩釋微丸表現(xiàn)出良好的緩釋特性,與上市產(chǎn)品Coracen?具有相似的體內(nèi)行為,進而為硝苯地平新型制劑的開發(fā)提供參考。

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