HPLC法研究根皮素的穩定性

張瑞濤,徐 媛,王慶偉

(第四軍醫大學唐都醫院藥劑科,西安 710038)

根皮素是一種被稱為維生素P的類黃酮化合物[1-2],是植物次生代謝產物,化學結構為3-(4-羥基苯基)-1-(2,4,6-三羥基苯基)-1-丙酮,包含4個酚羥基,獨特的化學結構決定了其強大的抗氧化活性[3-5]。根皮素主要存在于蘋果、梨和金橘等水果果皮中[6-9]。現代藥理學研究表明,根皮素具有多種生物學活性,對骨質疏松癥具有預防和治療作用,對心血管硬化、高脂血癥、肥胖癥和阿爾茨海默疾病也有影響[10-16]。

根皮素的不穩定性會影響根皮素的研究、生產和推廣應用,這也是根皮素相關制劑在加工和使用過程中一個急需解決的難題。本研究建立了一種簡單、靈敏、快速的測定根皮素含量的HPLC法[17-18],系統研究了溶劑、溫度、pH值和光照對根皮素穩定性的影響,為研制穩定的根皮素相關制劑提供強有力的理論依據[19-20]。

1 儀器與試藥

1.1儀器 1200型高效液相色譜儀(美國安捷倫科技有限公司,VWD紫外檢測器)；CP225D型電子分析天平(德國Sartarius有限公司)；HH-1型恒溫水浴箱(北京科偉有限公司)；TGL20M型高速冷凍離心機(湖南湘儀有限公司)；UMV-1型多管漩渦混合器振蕩器(北京優晟聯合科技有限公司)；KH5200DV型超聲儀(浙江昆山禾創超聲儀器有限公司)；Milli-Q Advantage A10型超純水機(美國密理博有限公司)。

1.2試藥 根皮素(第四軍醫大學藥物化學教研室提供,質量分數>99%)；磷酸(天津科密歐化學試劑開發中心)；磷酸氫二鈉(國藥集團化學試劑有限公司)；鹽酸(西安市長安精細化工廠)；氫氧化鈉(天津恒興化學試劑制造有限公司)；甲醇、乙腈(色譜純,美國Tedia公司提供)。

2 方法與結果

2.1根皮素HPLC測定方法的建立

2.1.1色譜條件與系統適用性 色譜柱：Inertsil ODS-3(150 mm×4.6 mm,5 μm)；流動相：乙腈-水(45∶55)；檢測波長：280 nm；柱溫：30 ℃；進樣量20 μL;流速：1 mL·min-1。 色譜圖見圖1。

圖1HPLC圖

1.根皮素。

Fig.1 HPLC chromatograms

1.phloretin.

2.1.2溶液的配制

2.1.2.1磷酸鹽緩沖液 取磷酸16.6 mL，加水至1 000 mL使溶解,作為A液；取磷酸氫二鈉71.63 g,加水至1 000 mL使溶解,作為B液；取A、B不同體積,混合,精確配制成pH值分別為3.0,4.0,5.0,6.0,7.0,8.0和9.0的系列溶液。

2.1.2.2對照品溶液 精密稱取根皮素對照品10 mg,加甲醇制成質量濃度為1 mg·mL-1的溶液,即得。

2.1.3線性關系考察 精密稱取根皮素10 mg,置于100 mL量瓶中,用甲醇溶解并稀釋至刻度,搖勻,作為儲備液；取儲備液適量,分別稀釋成質量濃度為100,50,25,10,2和1 μg·mL-1的系列溶液。按照2.1.1項下色譜條件,進樣20 μL,以峰面積為縱坐標y、根皮素質量濃度為橫坐標x進行線性回歸,得回歸方程y=74.680x+10.087,r=0.999 2,結果表明,根皮素質量濃度在1～100 μg·mL-1范圍內線性關系良好。

2.1.4精密度實驗 精密吸取根皮素對照品溶液,連續進樣6次,每次20 μL,按照2.1.1項下色譜條件進行測定,測得RSD值為1.06%,結果表明，儀器精密度良好。

2.2根皮素影響因素的考察 對根皮素進行強酸(1 mol·L-1HCl)、強堿(1 mol·L-1NaOH)、強光、強氧化(30 mL·L-1H2O2)、高溫(100 ℃)破壞,初步結果表明,根皮素在強酸、強光、高溫環境下較穩定,在強堿、強氧化條件下不穩定,尤其在強堿下根皮素迅速降解。

2.2.1室溫下根皮素在不同溶液中的穩定性實驗 取pH 值分別為3.0,4.0,5.0,6.0,7.0,8.0和9.0的緩沖液及水、0.1 mol·L-1HCl、30 mL·L-1H2O2各100 mL,分別加入根皮素4 mg,超聲處理15 min,振蕩搖勻,以3 000 r·min-1離心10 min,取上清,過濾,分別在0,1,2,4,6,8,12和24 h取樣,微孔濾膜濾過,取續濾液,按照2.1.1項下色譜條件測定峰面積,用標準曲線回歸方程計算溶液中根皮素含量,以質量濃度C(μg·mL-1)對時間t作圖。見圖2。

圖2根皮素在室溫下的質量濃度變化曲線

Fig.2 The concentration curve of phloretin at room temperature

2.2.235,55和75 ℃下根皮素在不同pH值緩沖液及水中的穩定性實驗 實驗結果表明,根皮素在堿性條件下降解速度較快,因此實驗只考察pH值為3.0,4.0,5.0,6.0,7.0的緩沖液及水、0.1 mol·L-1HCl和30 mL·L-1H2O2中的不同溫度的穩定性,取pH值為3.0,4.0,5.0,6.0和7.0的緩沖液及水、0.1 mol·L-1HCl和30 mL·L-1H2O2各100 mL,分別加入根皮素4 mg,超聲處理15 min,振蕩搖勻,以3 000 r·min-1離心10 min,取上清液置于EP管中,進行HPLC測定,作為0 h點,其余分別置于35,55和75 ℃的恒溫水浴中,分別在0,1,2,4,6,8,12和24 h取樣,微孔濾膜濾過,取續濾液,按照2.1.1項下色譜條件測定峰面積,用標準曲線回歸方程計算溶液中根皮素含量,以藥物殘留百分比的自然對數對時間t作圖。見圖3～5。

由圖3～5可知,根皮素的降解曲線基本符合一級動力學方程。按照一級動力學方程,求出不同溫度和pH值下的根皮素的降解反應速度常數K值,見表1。

圖3根皮素在35℃不同pH值緩沖液中的降解曲線

A.0.1 mol·L-1HCl；b.pH3.0；c.pH4.0；d.H2O；e.pH5.0；f.pH6.0；g.30 mL·L-1H2O2；h.pH7.0。

Fig.3 The degradation curves of phloretin in different pH solutions at 35 ℃

A.0.1 mol·L-1HCl；b.pH3.0；c.pH4.0；d.H2O；e.pH5.0；f.pH6.0；g.30 mL·L-1H2O2；h.pH7.0.

圖4根皮素在55℃不同pH值溶液中的降解曲線

A.0.1 mol·L-1HCl；b.pH3.0；c.pH4.0；d.H2O；e.pH5.0；f.pH6.0；g.30 mL·L-1H2O2；h.pH7.0。

Fig.4 The degradation curves of phloretin in different pH solutions at 55 ℃

A.0.1 mol·L-1HCl；b.pH3.0；c.pH4.0；d.H2O；e.pH5.0；f.pH6.0；g.30 mL·L-1H2O2；h.pH7.0.

圖5根皮素在75℃不同pH值溶液中的降解曲線

A.0.1 mol·L-1HCl；b.pH3.0；c.pH4.0；d.H2O；e.pH5.0；f.pH6.0；g.30 mL·L-1H2O2；h.pH7.0。

Fig.5 The degradation curves of phloretin in different pH solutions at 75 ℃

A.0.1 mol·L-1HCl；b.pH3.0；c.pH4.0；d.H2O；e.pH5.0；f.pH6.0；g.30 mL·L-1H2O2；h.pH7.0.

表1降解反應速度常數K

Tab.1 The degradation constantK

溫度/℃H2OHClH2O2pH3.0pH4.0pH5.0pH6.0pH7.0350.0200.0030.0360.0150.0160.0260.0310.072550.0490.0060.6250.0260.0380.0510.1571.463750.0890.0182.2860.0610.0730.1051.3894.403

根據Arrhenius公式可以求出室溫下的降解反應速度常數K,由其可求出降解10%的時間,即有效期t0.9,求得相同pH值以及不同溶液下的直線方程,見表2。

2.2.3室溫25 ℃下根皮素在不同溶液中的最大溶解度 分別取各溶液10 mL,置于離心管中,加足量的根皮素,然后超聲15 min,振蕩搖勻,以3 000 r·min-1離心10 min,取上清液,濾膜過濾,進行HPLC測定,得色譜峰峰面積,以外標法計算各個溶液的質量濃度,實驗重復3遍,取平均值。見表3。

表2根皮素水解Arrhenius方程和t0.9

Tab.2 The Arrhenius equation of phloretin hydrolysis andt0.9

項目Arrhenius方程rK(T=298)t0.9(h)H2OLnK=9.1456-4011.7/T0.99680.0133007.900.1mol·L-1HClLnx=9.6078-4773.2/T0.98640.00164664.0030mL·L-1H2O2Lnx=33.224-11194/T0.98420.0130008.08pH3.0LnK=7.8756-3737.9/T0.98740.00940011.20pH4.0LnK=9.1101-4073.8/T0.99890.01000010.00pH5.0LnK=8.4499-3733.1/T0.99840.0170006.22pH6.0LnK=29.344-10146/T0.99280.00900011.60pH7.0LnK=33.708-11112/T0.97440.0278003.78

表3室溫下不同溶劑根皮素的最大溶解度

Tab.3 Maximum solubility of phloretin in different solvents at room temperature

溶劑最大溶解度/μg·mL-1H2O47.40.1mol·L-1HCl25.730mL·L-1H2O225.3pH3.013.6pH4.016.5pH5.017.1pH6.022.2pH7.055.34

3 討論

在影響因素考察實驗中,根皮素在強氧化性條件下不穩定,在堿性條件下迅速降解,而其對強酸、強光、高溫較穩定。筆者研究了根皮素在pH值為3.0,4.0,5.0,6.0和7.0的緩沖液及水、30 mL·L-1H2O2和0.1 mol·L-1HCl 中的恒溫加速實驗以及室溫下根皮素在不同pH值緩沖液及水溶液、30 mL·L-1H2O2中的最大溶解度。實驗結果表明,根皮素在酸性環境下比較穩定,根皮素在溶液0.1 mol·L-1HCl,pH3.0,pH4.0,水,pH5.0,pH6.0,30 mL·L-1H2O2,pH 7.0緩沖液中的穩定性依次降低,對于根皮素及其相關產品的研究具有重要意義。

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