新型胰高血糖素樣肽-1類似物的合成及降糖活性

周 鳳,陳心雨,費穎穎,韓 京

(江蘇師范大學化學與材料科學學院,徐州 221116)

糖尿病，尤其是2型糖尿病是繼腫瘤、心血管疾病之后的第三大嚴重威脅人類健康的慢性非傳染性疾病[1-3]。目前,全球約有2億糖尿病患者,預計到2030年將增加至3.6億,其中2型糖尿病約占糖尿病患者總人數的90%以上[4]。現有的一些口服降糖藥物是目前治療糖尿病的主要藥物。但口服降糖藥物最大的不足是無法逆轉糖尿病的病因,即“治標不治本”,對于胰島β-細胞的生長、分化和增殖無明顯作用[5-7]。

胰高血糖素樣肽-1(Glucagon-like peptide-1,GLP-1)是葡萄糖依賴性地促胰島素分泌腸降血糖多肽激素,能安全降血糖,還可以保護、修復、分化、增殖胰腺β-細胞,同時還具有抑制食欲和胃酸分泌、延遲胃排空等生理作用。雖然GLP-1降血糖的優點突出,但是天然GLP-1半衰期過短的缺陷使其無法在臨床應用。GLP-1在體內會被二肽基肽酶IV(DPPIV)快速水解。GLP-1在體內還會被中性內切酶(NEP 24.11)識別并降解及被腎臟快速清除,其半衰期僅為2 min左右[8-10]。

目前GLP-1受體激動劑類藥物的研究都是基于天然GLP-1和Exendin-4進行結構修飾,這限制了新型GLP-1受體激動劑的研發[11]。本文以前期研究發現的非洲爪蟾GLP-1(XenGLP-1)作為先導多肽[12],先在XenGLP-1的C端引入促螺旋序列PSSGAPPPS以增加XenGLP-1的降糖活性。同時,為了定點、定量地實現XenGLP-1的PEG化,對其進行半胱氨酸定點替換,從而在肽鏈上引入巰基,設計了ZF-1和ZF-2 2條多肽。進一步利用MAL-PEG2 000通過半胱氨酸的巰基與設計了ZF-1和ZF-2 2條多肽相綴合,得到PEG化的PEG2 000-ZF-1和PEG2 000-ZF-2 2個綴合肽,并對綴合肽進行長效降糖活性研究。

1 儀器與材料

1.1儀器 SI Model 200型多肽合成儀(美國多肽科技有限公司)；Agilent 1260高效液相色譜儀(美國Agilent公司)；漢邦制備液相色譜儀(江蘇漢邦科技有限公司)；ThermoHypersil Gold C18制備柱(250 mm×20 mm,12 μm)；真空冷凍干燥機(Labconco公司)；Ultimate 3000 analytical 液質聯用質譜儀(美國Thermo公司)；ME104E型萬分之一天平(美國Mettler-Toledo公司)；BT25S型十萬分之一天平(德國Sartorius集團)；血糖儀與試紙(中國三諾生物傳感股份有限公司)。

1.2試藥 xendin-4(吉爾生化公司,批號 P141017-LR052143)；MAL-PEG2 000(西安瑞禧生物科技有限公司,批號RM2016011)；Rink Amide MBHA 樹脂、Fmoc保護氨基酸、1-羥基-苯并三氮唑(HOBt)、N,N-二異丙基碳二亞胺(DIC)、苯甲硫醚(thioanisole)和二巰基乙烷(EDT),均購自上海吉爾生化有限公司(批號GLS160405-36607)；哌啶、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、三氟乙酸(TFA)為重蒸試劑,苯酚(批號20150604)、茚三酮(批號20150520)等其他試劑均為國產分析純。茚三酮檢測試劑：A.體積分數為5%的茚三酮-無水乙醇溶液；B.體積分數為80%的苯酚-無水乙醇溶液。

1.3動物 清潔級ICR小鼠：7周齡,體質量為18～22 g,雄性[上海杰斯捷實驗動物有限公司,動物許可證號SCXK(滬)2013-0006]；清潔級db/db小鼠：7周齡,雄性[南京大學模式動物研究所,動物許可證號SCXK(蘇)2015-0001]。

2 方法和結果

2.1ZF-1和ZF-2多肽的合成 稱取 Rink Amide MBHA 樹脂(擔載量0.382 mmol·g-1)0.262 g(0.1 mmol),用二氯甲烷和甲醇(7 mL)交替清洗樹脂1次,用7 mL二氯甲烷清洗樹脂2次,加入10 mL二氯甲烷溶脹樹脂1 h。將溶脹后的樹脂移入多肽合成儀,以體積分數為20%的哌啶/DMF作為脫保護試劑,脫除Rink樹脂的Fmoc保護基。茚三酮檢測脫保護完全后,按照設計的類似物ZF-1和ZF-2的氨基酸序列,從C 端到N 端依次耦合,縮合試劑為DIC/HOBt(0.4 mmol/0.44 mmol)的DMF溶液,反應時間為2 h,采用茚三酮試劑檢測縮合和Fmoc脫保護的完全程度。多肽合成完畢后,用7 mL甲醇清洗樹脂3次,用氮氣吹干樹脂。使用切割劑Reagent R(TFA/苯甲硫醚/苯酚/EDT,90∶5∶3∶2)5 mL切割樹脂,室溫磁力攪拌切割2 h,過濾除去樹脂,切割液經冰乙醚沉淀,洗滌后得粗肽。

表1F-1和ZF-2序列

Tab.1 ZF-1 and ZF-2 sequences

化合物長度序列ZF-139肽HGEGTYTNDVTEYLCEKAAKEFIEWLIKGKPSSGAPPPSZF-239肽HGEGTYTNDVTEYLEEKAAKEFIEWLIKGCPSSGAPPPS

2.2ZF-1和ZF-2多肽的分析和純化

2.2.1分析方法 將目標多肽粗品溶于少量的水中,制成質量濃度為1 mg·mL-1的溶液,用0.25 μm微孔濾膜過濾,Agilent 1260高效液相色譜儀分析純度。色譜柱：Thermo Hypersil Gold C18反相分析柱(250 mm×4.6 mm,5 μm)。流動相A：體積分數0.1% TFA/水,流動相B：甲醇,梯度洗脫(0～10 min,B 50%～90%;10～15 min,B 90%～90%)。檢測波長：214 nm；流速：1 mL·min-1；柱溫：25 ℃；進樣量：20 μL。

2.2.2制備液相純化 制備純化條件：色譜柱：Thermo Hypersil Gold C18反相制備柱(250 mm×20 mm,12 μm)；流速：10 mL·min-1；樣品質量濃度：20 mg·mL-1；檢測波長：214 nm。流動相A：體積分數0.1% TFA/水,流動相B：甲醇,梯度洗脫(0～20 min,B 55%～90%;20～45 min,B 90%～90%)。收集主峰,合并質量分數大于95%的樣品,30 ℃減壓蒸餾除去甲醇,真空冷凍干燥后稱質量,將冷凍干燥后的純品貯存在-20 ℃冰箱中。

2.3質譜鑒定 Timate 3000 analytical 液質聯用質譜儀；使用體積分數為50%的甲醇/水溶解后進樣,錐孔電壓：50 V,毛細管電壓：3 910 V,N2流速：648 L·h-1,錐孔溫度：120 ℃,霧化室溫度：330 ℃。ZF-1和ZF-2純化后,通過質譜鑒定其相對分子質量,結果見圖1和表2。

表2ZF-1和ZF-2的質譜分析

Tab.2 Mass spectrometric analysis of ZF-1 and ZF-2

化合物相對分子質量多電荷相對分子質量計算值實測值ZF-14251.81418.2[M+3H]3+1418.7[M+3H]3+1064.0[M+4H]4+1064.3[M+4H]4+ZF-24252.71418.6[M+3H]3+1418.9[M+3H]3+1064.2[M+4H]4+1064.4[M+4H]4+

圖1ZF-1和ZF-2的質譜圖

Fig.1 Mass spectrogram of ZF-1 and ZF-2

2.4PEG2 000-ZF-1和PEG2 000-ZF-2綴合肽的合成 利用巰基和馬來酰亞胺可以快速、定點、定量的反應特征,在中性條件下,將ZF-1和ZF-2與MAL-PEG2 000綴合,得到PEG化的ZF-1和ZF-2綴合肽[13]。反應條件：將ZF-1和ZF-2與MAL-PEG2 000在pH值為7的條件下,以體積分數為50%的水/甲醇做溶劑,在DIEA的催化下反應0.5 h。使用安捷倫 HPLC監測反應進程,反應完全后,利用制備液相分離純化得到目標綴合肽,合成路線見圖2,PEG2 000-ZF-1和PEG2 000-ZF-2綴合肽的結構見圖3。

2.5EG2 000-ZF-1和PEG2 000-ZF-2綴合肽的結構鑒定 ltimate 3 000 analytical 液質聯用質譜儀；使用體積分數為50%的甲醇/水溶解后進樣,錐孔電壓：70 V,毛細管電壓：3 910 V,N2流速：648 L·h-1,錐孔溫度：120 ℃,霧化室溫度：330 ℃。通過質譜鑒定其相對分子質量,由于本研究中選擇的MAL-PEG2 000是平均相對分子質量為2 000的聚合物,PEG修飾后的化合物無法計算單個分子的相對分子質量,以質譜只能測定一組相差特定質荷比的呈正態分布的多電荷離子峰。圖3～4顯示的是一系列呈正態分布的多電荷離子峰,PEG2 000-ZF-1和PEG2 000-ZF-2的相對分子質量理論值為4 477.9±44n及4 478.8±44n(n代表在單個分子中“CH2CH2O”骨架的數量),通過計算其理論分子離子峰值,結果顯示與實測值一致。測定結果顯示，最終PEG2 000-ZF-1和PEG2 000-ZF-2的相對分子質量平均值為6 325.9和6 326.8(n=42)。PEG2 000-ZF-1和PEG2 000-ZF-2綴合肽的質譜數據見圖4和表3～4。

圖2PEG2 000-ZF-1和PEG2 000-ZF-2綴合肽的合成路線

Fig.2 The synthetic routes of the conjugated peptides of PEG2 000-ZF-1 and PEG2 000-ZF-2

圖3PEG2 000-ZF-1和PEG2 000-ZF-2綴合肽的結構

Fig.3 The structures of the conjugated peptides of PEG2 000-ZF-1 and PEG2 000-ZF-2

圖4PEG2 000-ZF-1andPEG2 000-ZF-2的質譜圖

Fig.4 The mass spectrogram of PEG2 000-ZF-1 and PEG2 000-ZF-2

表3PEG2 000-ZF-1的質譜分析結果

Tab.3 The results of mass spectrometric analysis of PEG2 000-ZF-1

na(m/z)計算值(m/z)實測值40[m+5H]5+1248.6[M+4H+Na]5+1253.0[m+5H]5+1248.8[M+4H+Na]5+1253.441[m+5H]5+1257.4[M+4H+Na]5+1261.8[m+5H]5+1256.9[M+4H+Na]5+1262.142[m+5H]5+1266.2[M+4H+Na]5+1270.6[m+5H]5+1266.3[M+4H+Na]5+1270.843[m+5H]5+1275.0[M+4H+Na]5+1279.4[m+5H]5+1274.8[M+4H+Na]5+1279.744[m+5H]5+1283.8[M+4H+Na]5+1288.2[m+5H]5+1283.5[M+4H+Na]5+1288.5

表4EG2 000-ZF-2的質譜分析結果

Tab.4 The results of mass spectrometric analysis of PEG2 000-ZF-2

na(m/z)計算值(m/z)實測值40[m+5H]5+1248.8[M+4H+Na]5+1253.2[m+5H]5+1249.2[M+4H+Na]5+1253.541[m+5H]5+1257.6[M+4H+Na]5+1262.0[m+5H]5+1257.8[M+4H+Na]5+1262.342[m+5H]5+1266.4[M+4H+Na]5+1270.8[m+5H]5+1266.7[M+4H+Na]5+1271.343[m+5H]5+1275.2[M+4H+Na]5+1279.6[m+5H]5+1275.8[M+4H+Na]5+1279.944[m+5H]5+1284.0[M+4H+Na]5+1288.4[m+5H]5+1284.3[M+4H+Na]5+1289.2

2.6生物活性的測定

2.6.1PEG2 000-ZF-1、PEG2 000-ZF-2綴合肽的短效降糖活性測試 小鼠腹腔糖耐量實驗是通過給予小鼠葡萄糖和受試化合物,依據空白組對照,測定不同時間的血糖水平,可以準確評估化合物的短效降血糖活性[14-15]。使用ICR小鼠來評價綴合肽的降糖活性,實驗方法：雄性ICR小鼠(體質量18～22 g),適應性飼養1周后,實驗前隨機分組,每組6只。自由飲水,禁食過夜(12 h)。在腹腔給予葡萄糖前10 min每組ICR小鼠分別腹腔注射生理鹽水(空白對照)、陽性對照GLP-1(25 nmol·kg-1)、受試化合物PEG2 000-ZF-1、PEG2 000-ZF-2(25 nmol·kg-1)；0 min腹腔注射葡萄糖(2 g·kg-1),于0,15,30,60和120 min在小鼠尾部斷尾取血，用血糖儀測定血糖值。見圖5。

由圖5可知,PEG2 000-ZF-1和PEG2 000-ZF-2綴合肽均有顯著的降糖活性,在15和30 min時的血糖數值與陽性對照GLP-1相當,說明PEG化綴合肽并沒有PEG的降糖活性。

圖5PEG2 000-ZF-1和PEG2 000-ZF-2的短效血糖時間曲線

Tab.5 Short-acting blood glucose and time curves of PEG2 000-ZF-1 and PEG2 000-ZF-2

2.6.2PEG2 000-ZF-1、PEG2 000-ZF-2綴合肽的長效降糖活性測試 db/db小鼠是一種2型糖尿病穩定可靠的動物模型,其正常血糖值基本在15 mmol·L-1以上,而正常小鼠的血糖值低于10 mmol·L-1,基于db/db小鼠的高血糖特點,設計db/db小鼠不禁食給藥降糖實驗[16-18]。db/db小鼠在腹腔注射PEG2 000-ZF-1和PEG2 000-ZF-2綴合肽后,自由飲食飲水,對照組db/db小鼠的血糖值會維持在高位,而注射綴合肽小鼠的血糖值會先下降,后隨著藥效的降低血糖值會緩慢回升。因此,通過比較化合物降低血糖的曲線及曲線下面積,可以準確評估化合物的長效降糖活性[19-20]。

6周齡雄性db/db小鼠,隨機分組,每組6只,適應性飼養(標準小鼠飼料,12 h光照,25 ℃)1周后,使用血糖儀測定各組小鼠的血糖數值,待各組小鼠血糖值高于15 mmol·L-1后開始實驗。陽性對照組給予exendin-4(25 nmol·kg-1)、化合物組給予PEG2 000-ZF-1、PEG2 000-ZF-2(25 nmol·kg-1),陰性對照組給予生理鹽水。0 h給予各組化合物及生理鹽水,各組小鼠自由飲水、飲食,于0,1,2,3,4,6,8,10,12,16,20和24 h在小鼠尾部斷尾取血,用血糖儀測定血糖,作血糖曲線,并計算曲線下面積。見圖6～7。

由圖6～7可知,PEG2 000-ZF-1和PEG2 000-ZF-2綴合肽在25 nmol·kg-1的劑量下,穩定血糖作用都優于陽性對照exendin-4。它們的血糖曲線下面積也顯著小于exendin-4,這說明PEG2 000-ZF-1和PEG2 000-ZF-2綴合肽不僅具有優異的降糖活性,其長效降糖作用也非常顯著,具有潛在的藥物開發前景。

圖6PEG2 000-ZF-1和PEG2 000-ZF-2的長效血糖時間曲線

Tab.6 Long-acting blood glucose and time curves of PEG2 000-ZF-1 and PEG2 000-ZF-2

圖7PEG2 000-ZF-1、PEG2 000-ZF-2的血糖曲線下面積

Tab.7 The area under the blood glucose curves of PEG2 000-ZF-1 and PEG2 000-ZF-2

3 小結

隨著生活水平的提高,糖尿病患者逐年遞增,因此,對于糖尿病治療藥物的研究具有重大意義。本研究將與人GLP-1具有相似生物活性的XenGLP-1作為先導多肽,先在XenGLP-1的C端引入增加活性的片段及Cys定點替換,再進行PEG長效化修飾,這既實現了PEG與XenGLP-1多肽定點、定量的綴合,又減輕了PEG化所導致的XenGLP-1多肽降糖活性的降低程度。

分別在ICR鼠和2型糖尿病db/db模型小鼠上評價了綴合肽的短效及長效降糖活性。活性實驗結果表明,PEG2 000-ZF-1、PEG2 000-ZF-2綴合肽不僅具有優異的降糖活性,也具有良好的長效降糖作用,值得進行深入的活性研究,具有開發成2型糖尿病治療藥物的前景。

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