電紡PLGA/HA/羊毛角蛋白復合支架的制備及性能研究

張華林 李夢璐 黃 金 王凱戎 馬海絨

（寧夏醫科大學口腔醫學院，寧夏銀川750004）

電紡PLGA/HA/羊毛角蛋白復合支架的制備及性能研究

張華林 李夢璐 黃 金 王凱戎 馬海絨

（寧夏醫科大學口腔醫學院，寧夏銀川750004）

目的 通過高壓靜電紡絲法制備PLGA/HA/羊毛角蛋白復合支架并對其理化性能、細胞相容性進行表征。方法先將聚乳酸-羥基乙酸共聚物（PLGA）與羥基磷灰石（Hydroxyapatite，HA）、羊毛角蛋白復合，采用高壓靜電紡絲法制備PLGA/HA/羊毛角蛋白復合支架，采用掃描電子顯微鏡（SEM）、紅外光譜（FTIR）、萬能力學測試機以及細胞培養等分析復合支架的理化性能及細胞相容性。結果 PLGA/HA/羊毛角蛋白復合支架是由長而連續的超細纖維相互交織構成的三維多孔結構，HA、羊毛角蛋白顆粒基本都被包裹于纖維內部；PLGA/HA/羊毛角蛋白復合支架的拉伸強度、斷裂伸長率和楊氏模量的平均值分別為4.16MPa、13.96%和135.55MPa；SD大鼠骨髓間充質干細胞在PLGA/MWNTs/羊毛角蛋白復合支架表面生長、增殖良好，HA和羊毛角蛋白的加入有利于細胞的粘附和生長。結論 通過高壓靜電紡絲法制得的PLGA/HA/羊毛角蛋白復合支架具有良好的表面形貌、力學性能和細胞相容性，在組織工程領域有較大的應用潛力，尤其是作為組織工程的支架用于組織再生。

靜電紡絲；PLGA/HA/羊毛角蛋白；復合支架；細胞相容性

嚴重創傷、腫瘤切除、感染、先天性畸形等所造成骨缺損的治療是現代醫學面臨的難題和巨大挑戰。目前臨床上常用的修復手段有自體骨移植、異體骨移植以及使用人工骨等，但以上方法均存在一定缺陷。因此，有必要尋找一種新的骨缺損的修復手段。

組織工程學的興起和發展，為彌補目前骨缺損治療方法的缺陷帶來了希望[1]。組織工程支架是骨組織工程的核心環節之一。目前骨組織工程支架材料包括無機材料和有機材料兩大類。但由于有機、無機的單一材料都存在一些不足，很難滿足理想的骨組織工程支架所要求的特性，所以可以通過合適的方法將幾種單一材料復合，形成復合型材料，取長補短，以解決理想的骨支架的問題[2]。高壓靜電紡絲，是一種利用聚合物溶液或熔體在強電場作用下形成噴射流進行紡絲加工的工藝[3]。由靜電紡絲制備出的納米纖維由于具有小尺寸、大比表面積和特殊的表面與界面效應，從而表現出傳統纖維材料所不具備的獨特性能。通過靜電紡絲技術制備的納米纖維材料，廣泛應用于軟骨、骨、皮膚、血管、神經等組織工程和修復再生方面[4-5]。

本研究將合成材料聚乙交酯-丙交酯共聚物（PLGA）、天然成分羊毛角蛋白和無機成分羥基磷灰石（HA）復合在一起形成復合材料，優勢互補，通過高壓靜電紡絲法構建PLGA/HA/羊毛角蛋白復合骨組織工程支架，并對其理化性能、細胞相容性進行表征。

1 材料與方法

1.1 電紡PLGA/HA/羊毛角蛋白復合支架的制備：

將PLGA溶于三氯甲烷和N，N-二甲基甲酰胺的混合溶劑中，濃度為15%w/v，待PLGA充分溶解后再加入5%w/v的HA以及5%w/v的羊毛角蛋白，室溫下攪拌30 min后超聲震蕩60 min。將紡絲液倒入10 mL注射器中，將注射器與電紡設備相連接進行靜電紡絲。

1.2 PLGA/HA/羊毛角蛋白復合支架的表征：用掃描電子顯微鏡（SEM）觀察膜的表面形貌；用傅立葉變換紅外光譜儀（FTIR）分析復合膜在4000～500 cm-1區間的紅外光譜圖；用萬能力學測試機測試復合膜的拉伸強度、彈性模量以及斷裂伸長率。將復合膜制成10 mm×70 mm的長條形試樣進行拉伸測試，每一組試樣的數量為5個，拉力機的拉伸速度為5 mm/min。

1.3 骨髓間充質干細胞的分離、培養、接種：骨髓間充質干細胞被置于含5 mL的α-MEM培養基的培養瓶中，將培養瓶置于37℃含5%CO2飽和濕度的培養箱中恒溫培養。將消毒后的支架放入6孔板中，第三代細胞經0.25%胰蛋白酶溶液消化后，將濃度為1×105個/mL的細胞懸液常規接種于支架表面，進行SEM觀察。

1.4 細胞增殖情況測定：將實驗組（PLGA/HA/羊毛角蛋白復合支架、PLGA/HA復合支架）和對照組（純PLGA支架）的樣品置于6孔板內，加入α–MEM培養基，然后將培養的細胞以1×105個/mL的密度接種于放有試樣的培養板內，分別在第1，3，5天測定各孔吸光度值，記錄結果。

1.5 統計學處理：采用SPSS 17.0統計學軟件進行分析，組間兩兩比較采用t檢驗，多組數據間采用方差分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

圖1純PLGA支架、PLGA/HA復合支架及PLGA/HA/羊毛角蛋白復合支架的SEM圖（3000×）。

2 結果

2.1 PLGA/HA/羊毛角蛋白復合支架的SEM觀察：三組都通過靜電紡絲的方法成功制備了長而連續的電紡纖維，三組支架均由超細纖維相互交織構成三維多孔結構，與天然的細胞外基質結構相似。純PLGA支架纖維表面光滑、直徑均勻；PLGA/HA復合支架纖維表面略粗糙，纖維局部可以看到團聚的HA顆粒，直徑沒有純PLGA纖維均勻；PLGA/HA/羊毛角蛋白復合支架纖維直徑明顯較純PLGA纖維小，纖維粗細不均，HA、羊毛角蛋白顆粒基本都被包裹于纖維內部，纖維局部可以看到團聚的HA和羊毛角蛋白顆粒，見圖1。

2.2 PLGA/HA/羊毛角蛋白復合支架的紅外光譜分析：HA納米顆粒的紅外光譜圖顯示了在1090cm-1，603cm-1和 566 cm-1處的PO43-吸收峰以及3500 cm-1附近的OH吸收峰。羊毛角蛋白在3424.14 cm-1處為氨基和羧基的伸縮振動峰，在1648.77 cm-1、1539.50 cm-1、1241.60 cm-1處均有強吸收峰，分別為α-螺旋構象的酰胺I譜帶、酰胺Ⅱ譜帶和酰胺Ⅲ譜帶的特征峰，說明羊毛角蛋白中含有大量的α-螺旋型構象，而且含有酰胺鍵，并且有多肽特征，是以α-螺旋型構象為主的蛋白質。PLGA/HA/羊毛角蛋白復合支架、PLGA/HA復合支架與純PLGA支架的紅外光譜圖很相似，并沒有出現HA以及羊毛角蛋白的特征峰，分析原因可能是由于復合支架中HA、羊毛角蛋白顆粒含量很少以及二者被包裹于纖維內部的原因，見圖2。

圖2 紅外光譜圖

2.3 PLGA/HA/羊毛角蛋白復合支架的力學性能分析：PLGA/HA/羊毛角蛋白復合支架的拉伸強度、斷裂伸長率和楊氏模量的平均值分別為4.16 MPa，13.96%和135.55 MPa，表明所制備的PLGA/HA/羊毛角蛋白復合支架具有一定的強度和柔韌性，能夠滿足支架材料的力學性能要求，詳見表1。

表1 PLGA/HA/羊毛角蛋白復合支架、PLGA/HA復合支架以及純PLGA支架的的力學性能指標 （x±s）

圖3 SD大鼠骨髓間充質干細胞的SEM圖

2.4 細胞與復合支架共培養SEM觀察：培養24h后，在純PLGA支架表面，粘附細胞數量較少，大部分細胞胞體呈細長梭形，面積較小，表明細胞尚未發生鋪展，少部分細胞己經鋪展呈多邊形。在PLGA/HA/羊毛角蛋白復合支架和PLGA/HA復合支架表面，細胞數量明顯較純PLGA組多，細胞己經開始鋪展，呈多突起狀借偽足附著于材料表面，見圖3。

2.5 細胞的增殖活性：三組細胞的數量都隨培養時間的增加而增加。PLGA/HA/羊毛角蛋白復合支架組的細胞數量較PLGA/HA復合支架組多（P＜0.05）。說明實驗組細胞增殖的速度和活性明顯高于對照組，PLGA/HA/羊毛角蛋白復合支架組高于PLGA/HA復合支架組。這可能是因為實驗組加入的HA和羊毛角蛋白增加了復合膜的親水性和生物活性，因此，也促進了SD大鼠骨髓間充質干細胞早期的粘附和增殖，見圖4。

3 討論

本研究通過高壓靜電紡絲法制備得到PLGA/HA/羊毛角蛋白復合支架。該復合支架具有良好的表面形貌、力學性能和細胞相容性，在組織工程領域有較大的應用潛力，尤其是作為組織工程的支架用于組織再生。

圖4 骨髓間充質干細胞MTT圖

［1］ Langer R，Vacanti JP.Tissue Engineering［J］.Science，1993，260（2）：920-926.

［2］ Zhang HL，Chen ZQ.Fabrication and ccharacterization of electrospun PLGA/MWNTs/hydroxyapatite biocomposite scaffolds for bone tissue engineering［J］.Journal of Bioactive and Compatible Polymers，2010，25（2）：241-259.

［3］ 張文.PPV和PPV/PVA電紡纖維的研制與性能研究［D］.沈陽：東北大學，2006.

［4］ Spasova M，Stoilova O，Manolova I，et al.Preparation of PLLA/PEG nanofibers by electrospinning and potential applications ［J］.Journal of Bioactive and Compatible Polymers，2007，22（3）：62-76.

［5］ Piras AM，Chiellini F，Chiellini E，et al.New multicomponent bioerodible electrospun nanofibers for dual-controlled drug release［J］.Journal of Bioactive and Compatible Polymers，2008，23（6）：423-443.

Study on Preparation and Properties of Electrospun PLGA/HA/wool keratin Composite Scaffold

Zhang Hualin Li Menglu Huang Jin Wang Kairong Ma Hairong
（College of Stomatology，Ningxia Medical University，Yinchuan 750004，China）

Objective To prepare the PLGA/HA/wool keratin composite scaffold by electrospinningand study its physical and chemical properties and cell biocompatibility.Methods The PLGA/HA/wool keratin composite scaffoldwas prepared by electrospinning；then，SEM，FTIR，universal mechanical testing machine and cell culture were used for characterization.Results The PLGA/HA/wool keratin composite scaffold，composed of long and continuous superfine fibers，had a three-dimensional and porous structure.HA and wool keratin particles were wrapped inside the fibers；SD rat bone marrow mesenchymal stem cells grew well on the surface of PLGA/HA/wool keratin composite scaffold，and the addition of HA and wool keratin was beneficial to cell adhesion and growth.Conclusion The electrospun PLGA/HA/wool keratin composite scaffold has good surface morphology，mechanical properties and biocompatibility，and it may have great potential applications in the field of tissue engineering，especially as a scaffoldfor tissue regeneration.

Electrospinning；PLGA/HA/wool keratin；Composite scaffold；Cell compatibility

R783.1

A 學科分類代碼： 32044

1001-8131（2017）06-0501-04

寧夏自然科學基金項目資助N217073；大學生創新實驗項目（寧教高（2013）254號）

2017-05-18