近海魚類多樣性調查新方法—環境DNA分析技術

高天翔，陳 治，王曉艷

（1.浙江海洋大學水產學院，國家海洋設施養殖工程技術研究中心，浙江舟山 316022；2.中國海洋大學水產學院，山東青島 266003）

傳統魚類多樣性調查方法具有諸多缺點[1-2]。近年來，以PCR、定量PCR及DNA條形碼技術為基礎，結合第二代高通量測序技術的環境DNA分析被廣泛地應用于生態學研究中[3-6]。該方法直接從環境樣品中提取DNA，采用定量檢測、生物信息學分析等手段，實現對樣品中所存在物種的有效檢測，在近海魚類多樣性調查方面具有重要的實際意義和良好的應用前景。

1 環境DNA分析技術的概念及產生背景

生物多樣性是維持生態平衡、促進人與自然和諧發展的重要成分，是生態系統穩定的關鍵因素，也是生態系統對環境變化響應與適應的重要指標。準確掌握水生生物在水體環境中的生物量及其時空分布是開展水生生物物種多樣性保護的基本前提和重要基礎[3]。以往的魚類多樣性調查主要采用圍網、拖網、電魚等傳統研究方法[1-2,7-9]。這些調查方法普遍具有以下缺點：（1）調查費用高、所需時間久。水生生物調查，不僅需要準備網具、租賃船只，還需配備完整的調查人員和船舶駕駛人員。燃油動力費及人員勞務費亦是傳統資源調查難以縮減的開支。一般性的魚類多樣性調查，少則幾天，多則數年。費用高、時間久是傳統調查方法的一個顯著缺點[8]。（2）目標生物捕獲率低[8-9]。水生生物，尤其是以魚類為代表的水生游泳動物，往往具有較強的游動性，在水域出現的位置是不固定的。網具抓捕及魚群探測器調查的結果具有很大的不確定性。調查面積及探測范圍相對有限，水中魚類等亦能根據“視聽”等信息對網具和調查船只進行規避性游動。水域生態系統構成復雜，有些物種因體型小、數量少、隱蔽性強等原因難以被抓獲，這使得魚類多樣性調查極為困難。因此調查結果往往不盡人意，基于傳統調查方法的海洋魚類捕獲率普遍偏低[8-9]。（3）物種鑒別困難[8]。傳統形態分類，需要專門的物種鑒別知識[10-11]。有些生物在特定的生長發育階段極難鑒定種屬，比如海洋魚類的幼魚及仔稚魚時期，一般人員很難對捕獲的漁獲物進行準確定種。（4）環境破壞性大[1-2]。拖網、圍網、電捕魚、實地考察等傳統方法搜集物種信息的方法，不僅對研究對象存在潛在傷害，而且對生物的棲息地環境存在程度不等的影響[8-9]。特別是拖網作業，對魚類賴以生存的水域生態環境破壞巨大，極易導致海底生境荒漠化[12]。

簡單、準確的物種多樣性調查新方法，是更好進行水生生物監測工作的一個難點。環境DNA（environmental DNA，eDNA）分析技術，能夠有效克服傳統魚類多樣性調查方法的諸多缺點。環境DNA是生物體釋放于環境中的DNA總稱，主要來源于生物體的配子、皮膚碎屑、粘液或排泄物等[7]。從環境樣品（水體、土壤、空氣等）中直接提取DNA，不對任何目標生物進行分離，即監測生物存在信息的這種方法，在20世紀80年代末首先應用于微生物群落研究。隨后20年間，環境DNA分析法在土壤、凍土、淡水和海水等環境中的微生物群落多樣性和功能基因組研究中逐漸成型。

2 環境DNA分析技術的主要實現方法

環境DNA分析，主要通過PCR、定量PCR和高通量測序（Next Generation Sequencing，NGS）技術實現[3-11]。PCR，特別是定量PCR可對單一目標物種的存在、生物量及時空分布進行檢測。無論是化石中的古生物、泥樣中的生物殘骸，還是水樣中所遺留的生物毛發、皮膚、粘液或血液，只要能分離出少許的環境DNA樣本，就能通過PCR加以放大，進行分析。這正是環境DNA結合定量PCR技術的威力所在。普通PCR只能對終產物進行分析，無法對起始模板準確定量；而且只能在反應結束后借助電泳方法分析，無法對擴增反應實時檢測；電泳檢測的EB染液往往有毒[13]。而定量PCR技術，則擺脫了普通PCR技術的上述限制。其中，實時熒光定量PCR（qPCR）技術是利用熒光信號的變化實時檢測PCR擴增反應中每一個循環擴增產物量的變化，通過Ct值和標準曲線實現對環境樣本起始模板的定量分析[13]。qPCR技術因其快速、簡易和經濟的特點，目前被各實驗室廣泛使用。但qPCR技術所謂的“定量”仍然是相對的，依賴于Ct值和標準曲線。在目的序列含量低、表達量差異十分微小、反應體系中含大量背景序列或抑制物等情況下，靈敏度和精確度都受到很大限制。數字PCR（dPCR）則是通過檢測每個反應單元的熒光信號，最終根據泊松分布和熒光信號陽性的反應單元占所有反應單元的比例來直接計算目的核酸序列的拷貝數[13-14]。較qPCR技術有著高靈敏度、高精確度、高耐受性和絕對定量的四大優勢[14]。無論是普通PCR或者定量PCR，都需要種間特異性高、種內通用性強的擴增引物，否則極易出現假陽性或者假陰性的錯誤結果。兩種定量PCR技術都只能對單一目標物種進行特異性檢測。

傳統DNA條形碼技術是用基因組內一段標準化的DNA片段來鑒定生物物種的分子鑒定技術，已被廣泛用于物種快速鑒定及起源、進化等研究領域[11]。但環境樣本中的DNA往往為許多物種的總DNA。基于一代測序技術的DNA條形碼分析和基于定量PCR分析的檢測手段無法對環境DNA進行物種多樣性監測研究。隨著第二代測序技術的迅速發展，DNA高通量條形碼（DNA metabarcoding）技術應運而生，給環境DNA研究帶來了前所未有的革新[10,15]。DNA metabarcoding技術通過提取環境樣品中的DNA并使用條形碼基因通用引物進行擴增，利用PCR和第二代測序等分子技術，可以在短時間內獲得可操作分類單元（operational taxonomic units,OTUs），通過與具有可靠物種分類信息的DNA條形碼參照序列進行比對，從而實現對大量樣本的物種鑒定及目標物種的信息獲取[16-17]。與PCR、定量PCR及傳統的DNA條形碼技術僅能從單一樣品中獲取DNA信息相比，DNA metabarcoding技術能夠直接從環境樣品或生物混合樣品中大批量識別物種，可對多物種進行同步檢測，更加省時、高效、低成本，能夠滿足當前生物多樣性快速評估的需求[18-19]。

3 環境DNA分析技術的優勢

及時、準確掌握生物在環境中的分布、豐富度、群落形態是有效保護生物的基礎[20]。海洋占地球表面積的71%，種類繁多的海洋生物是生物多樣性研究的寶庫。但由于海洋生物種類繁多、生活空間廣闊，尤其是魚類幼體浮游生活期長、分布范圍內不存在明顯地理屏障等，多數海洋魚類群體通常在較大的分布范圍內遺傳分化很低，且其遺傳結構在時間上具有不穩定性[21-22]。因此，研究海洋生物物種多樣性和群體間相互關系等問題對于圍網、拖網、電魚等傳統生態學研究方法存在較大挑戰。同時，隨著環境變化和全球范圍內過度捕撈的加劇，許多海洋魚類多樣性已嚴重衰退，種群崩潰現象日益嚴重。高營養級的大型魚類在漁獲物中所占比例下降，而小型魚類以及無脊椎動物等低營養級生物比重逐漸上升[23]。采用傳統生態學調查方法，勢必會對物種本身及其棲息地環境造成一定程度的損害，客觀上加劇魚類多樣性的衰退速度。在海洋生態系統受損、食物網結構日趨簡化、傳統調查方法捉襟見肘的大背景之下，利用環境DNA技術，特別是環境DNA metabarcoding方法評估海洋生物多樣性，量化分析關鍵種的資源豐富度，揭示其生態功能和作用，對指導海洋生物資源的保護及合理開發利用、探討生物適應環境的遺傳學機制具有重要意義。

與傳統調查方法相比，環境DNA分析技術具有以下顯著特點：（1）省時、省力、費用低。對亞洲鯉魚Cyprinus carpio的研究，研究者采用電捕魚監測法用時93 d，而eDNA技術只用了0.174 d[24]。對環境DNA分析所需要的現場調查，只需幾升水而已，所以不需要特別專業的技術，普通人都可以簡單地參與調查。既省去了船只租賃、人員勞務上的費用，又節省了調查作業及后續物種鑒定所需的時間。（2）調查靈敏度高。YAMAMOTO，et al[25]利用環境DNA技術對日本舞鶴灣魚類多樣性進行了調查，eDNA分析技術共檢測出128種海洋魚類。這128種海洋魚類中，有23種是過去14年采用傳統調查方法從未捕獲過的。表明環境DNA分析技術在海洋魚類檢測靈敏度上顯著高于傳統調查方法。（3）環境友好、對調查對象無損傷[1,9]。eDNA分析技術，需要的是水樣、底泥、空氣等環境樣本，不需要對調查對象進行直接抓捕。水樣及泥樣的獲取，僅需一部采水器或采泥器即可。與拖網作業等調查方法相比，最大限度減少了對調查生境的破壞。

4 環境DNA分析技術的應用

4.1 國外應用現狀

近年來，國外已成功將環境DNA技術應用于動植物的多樣性監測研究，基于環境DNA技術的水生生物研究文獻也越來越多，2016年發表論文近百篇。目前這一技術被廣泛應用于生物多樣性評價、水生生物監測和珍稀瀕危物種保護等研究領域[8-10]。

WILLERSLEV，et al[26]首次利用環境DNA分析法揭示了沉積物中滅絕的植物、哺乳動物及鳥類的物種組成的多樣性，標志著環境DNA分析在生物學研究中的應用從低等的微生物擴展至高等的動植物。2008年FICETOLA，et al[7]將這一技術引入水生生物研究領域，利用水中提取的DNA來監測美國牛蛙Rana catesbeiana的分布狀況，開啟了水生生物實時監測應用研究。THOMSEN，et al[27]首次嘗試利用環境DNA技術對研究水域中某些瀕危物種生物量進行估測。隨后JERDE，et al[24]利用水樣環境DNA分析法監測了密歇根湖及其周邊河流中鰱Hypophthalmichthys molitrix和鳙H.nobilis的擴散趨勢，結果表明這2種入侵魚的分布范圍已經超出了傳統調查法劃定的區域，為入侵物種的治理工作提供了準確的位置信息和預警資料。2013年，TAKAHARA，et al[28]利用eDNA技術追蹤入侵物種—藍鰓太陽魚Lepomis macrochirus在日本本土及周邊島嶼的擴散趨勢，發現環境DNA研究結果優于傳統資源調查結果。2015年，SIGSGAARD，et al[29]利用環境DNA分析技術，成功地從傳統分布區內檢測到了歐洲泥鰍Misgurnus fossilis的蹤跡，為物種保護補充了重要的地理分布信息。

2016年，SIGSGAARD，et al[30]利用環境DNA技術開展了世界上體型最大的魚類—鯨鯊Rhincodon typus的種群遺傳學研究，推算育齡雌性鯨鯊的數量約有71000頭，并認為出沒在埃爾沙辛油田海域的鯨鯊種群和印度洋—太平洋種群更為接近，該研究結果被評價為具有劃時代意義的“概念性進步”，“將環境DNA的研究推上了一個新高度”。DOI，et al[31]研究了佐波川河環境DNA濃度與香魚Plecoglossus altivelis的生物量關系，結果發現環境DNA技術是評估香魚生物量及其空間分布的有效手段。近幾年，人們也開展了兩棲類[32-34]、甲殼類[35-36]、軟體動物[37]等水生動物研究，進一步證實了環境DNA研究的有效性和可靠性。

除了用環境DNA定量檢測特定物種外，THOMSEN，et al[27]通過metabarcoding測序技術，對歐洲多國淡水系統的瀕危水生動物（魚類、兩棲類、鳥類、哺乳類、昆蟲）進行多樣性檢測，研究結果一方面支持環境DNA在水體環境的廣泛分布性，另一方面證明metabarcoding技術對不同生物分類群具有普遍適用性，能夠可靠用于珍稀和瀕危物種監測。YAMAMOTO，et al[25,36]通過日本海舞鶴灣魚類分布和環境DNA關系分析，結合網格化調查和聲學評估手段，得出表層水體環境DNA濃度與生物量調查結果呈顯著正相關的結論，認為環境DNA濃度不僅可反映竹莢魚Trachurus japonicus生物量，而且在海洋魚類多樣性檢測靈敏度、結果可信度等方面均顯著高于傳統調查方法。

4.2 國內應用探討——以舟山漁場為例

國內關于環境DNA技術研究水生生物的研究很少，僅有三例相關報道[8-9]。馬竹欣[38]采用環境DNA技術監測了克氏原螯蝦Procambarus clarkii在元陽梯田的分布狀況和擴散動態，為這一外來入侵物種的防控提供了決策依據。徐念等[39]開展了長江中下游干流環境DNA分析工作，共獲得了10種魚類序列，為長江水生珍稀瀕危物種監測和多樣性評價提供了基礎依據。姜維等[40]開展了以川陜哲羅鮭Hucho bleekeri為目標物種的水樣環境DNA分析流程的優化工作，認為線粒體DNA控制區可作為鑒定川陜哲羅鮭的特異性分子標記。目前，eDNA分析技術在海洋魚類多樣性研究進展十分迅速，而我國相關研究報道幾乎是空白。對于典型海域、典型漁場，國內缺乏環境DNA技術的應用研究。

舟山漁場是我國最大的近海漁場，位處長江、錢塘江、甬江等河流的入海交匯區，東部受臺灣暖流的影響，西部主要受由三江等大陸徑流形成的沿岸水影響，北部還有黃海冷水團的季節性分布，形成獨特的水文環境。加上舟山海域上千個島嶼的分布，使其自然環境優越、餌料豐富，是眾多經濟魚類、蝦蟹類等多種水生動物的產卵繁殖和索餌育肥的好場所[41-42]，也是開展環境DNA技術應用研究的理想水域。雖然舟山漁場魚類物種豐富、生物多樣性高，但圍繞魚類資源的系統研究一直落后于漁業生產。有關舟山海域魚類的明確記載，最早見于1994年毛錫林、蔣文波先生主編的《舟山海域海洋生物志》[41]，共列出舟山海域魚類名錄317種，對其中68種魚類的形態、分布、經濟價值做了簡單描述。此后，其他學者根據新的發現和資料，從不同角度陸續予以了補充。1995年《舟山魚類多樣性調查和漁業區劃》（未公開發表）中一共記載了365種魚類，但未見具體魚類名錄。趙盛龍等[42]根據2000年4月至2005年4月采集的舟山海域魚類標本，結合標本館、研究所等現有標本的復查，以及有關文獻資料的核查，編著了《舟山海域魚類原色圖鑒》，該圖鑒匯集了該海域魚類467種（其中6種為國內外引進種），并簡要敘述了其形態特征、習性、利用和分布。2006年以后，有較多關于浙江沿海魚類新種和新紀錄種的報道。GAO，et al[43]通過形態特征和DNA條形碼研究，報道了鱚屬魚類新種—中國鱚Sillago sinica。一些新紀錄種如大口鯊Megachasma pelagios[44]、前肛臀棘鯛Paratrachichthys prosthemius[45]、長木葉鰈Pleuronichthys japonicus[46]等也相繼在舟山海域發現并描述。2012年4-7月，陳健等[47]在舟山海域采獲3種新紀錄魚類—平頭竿蝦虎魚Luciogobius platycephalus、日本長鱸Liopropoma japonicum、黑體網鳚Dictyosoma burgeri。同時，歷史上舟山漁場曾以盛產大黃魚Larimichthys crocea、小黃魚L.polyactis、帶魚Trichiurus lepturus、曼氏無針烏賊Sepiella japonica等四大海產而聞名。但由于捕撈過度和海洋環境污染的加劇，大黃魚和烏賊資源嚴重衰退已近枯竭[48-49]。

由此可見，舟山海域到底有多少種魚類？其資源分布及其特性如何？巨大的捕撈壓力和人類活動影響下，魚類生物多樣性受到何種程度的威脅？該海域重要經濟魚種的又有何現狀和特點？亟需深入研究。而以往的海洋魚類多樣性研究主要采用圍網、拖網、電魚等傳統調查方法。具有目標生物捕獲率低、物種鑒別困難、環境破壞性大、調查過程費時費力的缺陷[1-11]。同時，舟山海域有1 390個島嶼，星羅密布的島嶼更大大限制了舟山近海魚類多樣性的常規監測，島礁密布區常常無法開展魚類多樣性拖網調查。以舟山近海為案例，采用環境友好、采樣簡便、快速準確的環境DNA分析技術，對魚類生物多樣性及其資源量評估進行研究意義重大。

首先，舟山海域水體泥沙含量高、水體渾濁度大。獨特的水文環境導致eDNA的提取具有很大的難度[39]。亟待明確影響環境DNA提取效果的主要因素，確立受河口影響渾水區水樣的最適eDNA提取方法。在該海域開展高質量eDNA的提取方法的探索實驗，具有很大的代表性和針對性。可采用沉淀和抽濾等方法相結合的方式獲取海水中的eDNA，同時采集底泥來獲取底泥中eDNA，通過控制變量和多重交叉方案同步進行，探索舟山近海水樣eDNA提取過程中關鍵環節，并對提取的水樣環境DNA進行核酸定量分析，結合絕對定量PCR檢測，確定適用于舟山近海的高質量環境DNA提取方法[13-14]。

其次，大黃魚、小黃魚、帶魚和墨魚（曼氏無針烏賊）曾為舟山漁場的四大漁產[48-49]。20世紀70年代以來由于大批機動漁船輪番濫捕等原因，先后出現生長型和補充型群體數量減少過度，典型經濟魚類資源嚴重衰退的現象[48-49]。基于環境DNA技術對特定海洋魚種的生物量監測工作在國內還處于萌芽期。若能結合養殖場的大、小黃魚、曼氏無針烏賊等物種的繁育工作，對養殖水體eDNA進行實時定量分析，通過eDNA拷貝數與物種豐富度或密度進行回歸關聯分析，進一步建立實驗室水體eDNA濃度與生物量或豐度關系模型，并結合野外魚類多樣性調查數據對模型進行有效性驗證分析，則不僅有望定量評價四大漁產資源豐度及其在舟山島礁海域時空分布，同時可為其他物種的生物量相關研究提供技術參考。

最后，環境DNA metabarcoding技術在時間和資金成本上優于傳統調查方法，在減少海上調查成本、克服普通PCR和定量PCR只能對單一物種檢測的同時，不僅對水體中的全部海洋生物可進行同步檢測，還可以從種群密度很低的環境樣本中靈敏地檢測到物種的存在，增加發現新種、隱存種或者稀有物種的可能性，為生物多樣性保護和管理工作提供更為客觀、全面的本底資料[3-12,24-25]。采用環境DNA metabarcoding技術，開展海洋生物多樣性及時空分布監測，進行舟山海域魚類的準確、快速鑒定，可實現對舟山近海水生生物的有效調查，簡便且高效地闡明其生物多樣性（包括種類組成和生物量分布）。結合不同季節的魚類資源海上大面調查，雙向驗證舟山海域魚類的多樣性及其時空分布狀況。如果同步采用GIS技術，則能更好地實現監測和評價工作，建立一套完善的近海河口生物eDNA metabarcoding分析流程。研究結果不僅可以探索適用于舟山島礁海域漁業多樣性的環境DNA調查方法，為現有監測研究提供新的技術手段，也將為后續魚類多樣性調查評估及其保護管理提供技術支撐。

5 環境DNA分析技術展望

與傳統生物多樣性研究方法相比，環境DNA技術具有環境友好、靈敏度高、省時省力、對調查對象無損傷等優點。環境DNA分析技術應用于近海魚類多樣性評估，不僅能夠更全面地揭示魚類多樣性及其時空變化規律，評估重要經濟魚種生物量的時空分布，發現并描述新發現種類，為魚類多樣性的持續利用、保護與管理提供基礎資料，也將為其他水生生物資源調查研究提供參考，具有重要的實踐意義和良好的應用前景。

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