雞傳染性支氣管炎活疫苗生產(chǎn)工藝研究

劉濤 柳珊 何平有 鄒立宏 朱秀同 王帥/瑞普（保定）生物藥業(yè)有限公司

劉子偉 翟含流/保定市蓮池區(qū)動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所

吳浩/保定市農(nóng)業(yè)局

雞傳染性支氣管炎( Infectious bronchitis，IB)是由冠狀病毒科冠狀病毒屬的傳染性支氣管炎病毒(Infectious bronchitis virus，IBV)引起的一種急性、高度接觸性傳染病，給養(yǎng)禽業(yè)帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)損失，疫苗免疫是防控該病的有效手段。本文對(duì)可能影響雞傳染性支氣管炎活疫苗毒液效價(jià)的幾個(gè)主要生產(chǎn)工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化試驗(yàn)，以期提高批次間毒液效價(jià)穩(wěn)定性，提升生產(chǎn)效率。

一、材料

SPF雞胚、0.01M PBS、雞傳染性支氣管炎病毒H120株種毒（IB種毒）均由瑞普（保定）生物藥業(yè)有限公司生產(chǎn)部提供。

二、方法

1.接種日齡的優(yōu)化。將IB種毒用PBS稀釋100倍，按0.1 ml/胚分別接種到10日齡、11日齡、12日齡SPF雞胚，棄去24 h內(nèi)死亡雞胚，每日照蛋2次，及時(shí)冷藏死亡雞胚，36 h全部收獲；分別測(cè)定不同日齡接種雞胚繁殖的毒液效價(jià)及收獲量。

2.種毒稀釋倍數(shù)、收獲時(shí)間的優(yōu)化。將IB種毒用PBS分別稀釋10、100、1 000倍，按0.1 ml/胚接種到11日齡雞胚，棄去24 h內(nèi)死亡雞胚，每日照蛋2次，及時(shí)冷藏死亡雞胚，每個(gè)稀釋倍數(shù)分30 h、36 h、42 h、48 h進(jìn)行收獲；分別測(cè)定不同稀釋倍數(shù)、不同收獲時(shí)間繁殖的毒液效價(jià)及收獲量。

3.冷蛋時(shí)間的優(yōu)化。將IB種毒用PBS稀釋1 000倍，按0.1 ml/胚接種到11日齡SPF雞胚上，每日照蛋2次，棄去24 h內(nèi)死亡雞胚，及時(shí)冷藏死亡雞胚，42 h將全部雞胚放置4℃進(jìn)行冷蛋，冷蛋時(shí)間分4 h、12 h、24 h，收獲毒液，測(cè)定效價(jià)及收獲量。

三、結(jié)果與分析

1.接種日齡的優(yōu)化。結(jié)果顯示接種10、11日齡雞胚收獲的毒液量不同，但毒液效價(jià)差異不大，11日齡雞胚接種后毒液收獲量較10日齡的高0.6 ml/胚；12日齡雞胚接種收獲的毒液效價(jià)低，且尿酸鹽較多，影響后續(xù)保存效果；因此優(yōu)選11日齡作為接種日齡。具體見(jiàn)表1。

表1 接種日齡試驗(yàn)結(jié)果

2.種毒稀釋倍數(shù)、收獲時(shí)間的優(yōu)化。結(jié)果顯示隨著稀釋倍數(shù)增大，毒液效價(jià)達(dá)到106.5EID50/0.1 ml以上所需的收獲時(shí)間越長(zhǎng)，10、100和1 000倍稀釋，效價(jià)達(dá)到峰值的時(shí)間分別為36、42和42 h；但1 000倍稀釋42 h收獲效價(jià)為107.1EID50/0.1 ml，明顯高于其他稀釋倍數(shù)；因此優(yōu)選1 000倍稀釋，42 h收獲。具體見(jiàn)表2。

表2 種毒稀釋倍數(shù)、收獲時(shí)間試驗(yàn)結(jié)果

3.冷蛋時(shí)間的優(yōu)化。冷蛋時(shí)間4 h，收獲毒液有溶血現(xiàn)象，不利于后續(xù)疫苗處理；12 h冷蛋充分，對(duì)收獲量、效價(jià)差異無(wú)影響；24 h雖冷蛋充分，但效價(jià)降低明顯，因此冷蛋時(shí)間優(yōu)選12 h。具體見(jiàn)表3。

表3 冷蛋時(shí)間試驗(yàn)結(jié)果

四、討論

針對(duì)IB毒液制備工藝各個(gè)參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，接種日齡由10日改進(jìn)為11日；稀釋倍數(shù)由10～100倍改進(jìn)為1 000倍；收獲時(shí)間由30～36 h改進(jìn)為42 h；冷蛋時(shí)間由24 h縮短至12 h；使IB毒液收獲量由9.8 ml/胚提高至11.1 ml/胚，效價(jià)由106.5EID50/0.1 ml提高至107.1EID50/0.1 ml。種毒用量越小，較少的繼代代次即可滿足生產(chǎn)需要，能更好保障生產(chǎn)毒液免疫原性。改進(jìn)的工藝不僅提高了毒液效價(jià)，還提高收獲量，效果顯著。

（略）